实训一 离子交换层析分离氨基酸.

实训一离子交换层析分离氨基酸

目的要求

1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法

2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作

实验原理

氨基酸是两性电解质，有一定的等电点，在溶液pH小于其pI值时带正电，大于其pI 时带负电。故在一定的pH条件下，各种氨基酸的带电情况不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。因而得到分离。

本实验选用Dowex 50作为离子交换剂，它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂，分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液，这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸，它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷，与Dowex 50的磺酸基团之间的亲和力不同，因此被洗脱下来的顺序亦不同，可以将三种不同的氨基酸分离开来，将各收集管分别用茚三酮显色鉴定。

试剂和器材

1．试剂

（1）0.1N NaOH

（2）氨基酸混合液：Gly、Asp、His各10mg溶于30m1 0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液中。（3）0.06M pH4.2柠檬酸钠缓冲液：取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中，再加入42ml 12N HCl 和6m1 80％苯酚(现用可不加苯酚)最终加蒸馏水至5000m1，用pH计凋溶液pH至 4.2。（4）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10m1乙二醇溶解。

（5）Dowex 50的处理：Dowex 50用蒸馏水充分浸泡后，用6N HCl浸泡煮沸1h，然后用蒸馏水洗去HCl至树脂呈中性，换15％NaOH浸泡1h，用蒸馏水洗去NaOH至树脂pH呈中性，最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡备用。

2．器材

（1）7220型分光光度计

（2）层析柱(0.8×18cm)

（3）试管

操作方法

1．装柱前准备

用流水冲洗层析柱、然后用蒸馏水冲洗，柱流水口装上橡皮管放入2-3ml蒸馏水，按压橡皮管内气泡，抬高流出管防止蒸馏水排空。

2．装柱

将处理好的Dowex 50悬液小心倒入层析柱内，待Dowex 50自然下沉至柱下部时，打开下端放出液体，再慢慢加入悬液至Dowex 50沉积面离层析柱上缘约3cm时停止。装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生。

3．平衡

用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面，平衡10min，最后接通蠕动泵，调节流速 1ml/min。

4．加样

柱内缓冲液的液面与树脂平面相平，但勿使树脂露出液面，马上用乳头滴管加7滴样品在树脂平面上（注意不能使树脂平面破坏），然后加少量缓冲液使样品进入柱内，反复两次，当样品完全进入树脂床后，接通蠕动泵，用PH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱，部分收集器收集。

5.收集与检测

取12支试管编号，每管即加入茚三酮显色液20滴，依次收集洗脱液每管2m1，混匀，置沸水浴15min取出，观色，用自来水冷却后在波长570mm处比色、当收集至第二洗脱峰刚

出现时，(茚三酮显色)即换用0.1N NaOH溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后，停止洗脱。6．树脂的再生

用o.1N NaOH溶液洗脱层析柱l0min。

7．回收树脂

拔去橡皮接收管用洗耳球对着玻璃流出口将树脂吹入装树脂的小瓶内加入 0.1N NaOH 浸泡。

8．洗脱曲线的绘制

以吸光度为纵座标，洗脱体积为横座标绘制曲线。