自由基及其检测
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氧自由基包括超氧阴离子自由基O2-、羟自由基 • OH 脂质自由基（LPO）是细胞膜上的不饱和脂肪酸 被自由基夺去电子后所产生的。 氮中心自由基：一氧化氮（NO）、过氧亚硝基阴 离子（ONOO-） 等。
自由基与机体损伤
在受控情况下对机体是有益的,也是必需的 自由基是能量传递的搬运工。 自由基可以帮助杀灭细菌、病毒和寄生虫 ，还能参与排除毒素。 信使分子。
体系中残留的过氧化氢再与钼酸胺作用生成黄色复 合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定
分光光度法检测SOD
1、细胞色素C还原法
SOD
歧化 O-2
黄嘌呤-黄嘌呤氧化 酶体系
氧化型细胞色素C
还原型细胞色素C 550nm
2、氯化硝基四唑氮蓝 （NBT）还原法
SOD NBT
清除 O-2 二甲臜 560nm
2.导致免疫系统功能紊乱 *自由基抑制淋巴细胞的增生分化，抑制其对刺激 原的反应性； *改变K细胞和NK细胞的结构及功能，使其对靶细胞 的识别能力减弱； *被自由基损伤的部分细胞自动修复，而修复后的 细胞具有了抗原性，干扰正常的免疫功能。 3.损伤基因，导致DNA变异 自由基可使DNA断裂或交联，从而诱发基因突 变或癌变。
技术的检测水平（10-6M -10-7M）
• 解决这一困难的重要方法之一是自由基捕
获技术
自由基(自旋)捕获反应 . R∗ + ST → R-SA∗
自由基
自旋捕获剂 (一般为抗磁 性物质 )
自由基加合物 （radical adduct, 长寿命自由基）
使自由基加合物的浓度积累到能被ESR检 测到的水平
自由基捕获剂
通用自旋捕获剂
特异自旋捕获剂
亚硝基化合物 或氮氧化合物
NO
O-2·
· OH
血红蛋白 N-甲基葡萄糖胺-铁 复合物（MGD）
1，2-二羟基苯-3， 5-二磺酸钠(Tiron) 5, 5-二甲基1-吡咯 啉N-氧化物(DMPO)
• 总结
优点
可在室温下进行检测，解决了生理条件下 水溶液中寿命极其短暂的自由基的定性和 定量问题。 缺点 有些自旋捕集剂对生物体有毒,有些易受到 血脑屏障限制,无法到达自由基生成的组织 部位; 被捕获的自由基不专一,而且ESR法难以清 晰的解释被捕获的自由基种类,需要待测自 由基的清除剂加以佐证; 仪器成本较高
化学发光法
回到 基态
释放能量 自由基
电子激发
吸收能量
发光剂
化学发光测试仪示意图
常用的发光试剂鲁米诺（氨基苯二酰 一肼）和光泽精（N，N二甲基二吖啶 硝酸盐）
鲁米诺（O-2、· OH、LPO、 NO ）
PH=10
酶 , Fe2 +, Co2 +, Ni2 +和 Cu2 +等过 渡金属离子或者 金属络合物
滴定过程中的主要反应式: H++Fe2++· OH→Fe3++H2O Cr2O72-+6Fe2++14H+→6Fe3++2Cr3++7H2O
• 总结 • 自动电位滴定由于不受指示剂以及人为判 断滴定终点的影响，操作过程中误差小， 分析结果准确度高、稳定性好。
• 该方法终点判断简单、操作简单、测定快 速、成本低廉，可作为一种简便易行的测 定羟自由基浓度的方法。
GSH-Px GSH+5,5’-DTNB 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子
二硫对硝基苯甲酸 于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算 出GSH减少的量
分光光度法检测自由基清除能力 (DPPH)
• DPPH・是一种稳定的自由基,其醇溶液呈深紫色,在
517nm处有一吸收峰。 • 当反应系统中存在自由基清除剂时,它可以和DPPH・ 的单电子配对而使517nm处的吸收峰渐渐消退。
*NO作为信使分子， 作用于平滑肌，使 血管扩张 硝酸甘油
自由基的危害
自由基过量，并失控时，机体的正常秩序就会被 破坏，并因此产生多种疾病。 自由基的损伤机理 1.损伤细胞膜结构 2.导致免疫系统功能紊 乱 3.损伤基因，导致DNA 变异
1.损伤细胞膜结构 自由基对细胞膜结构的损伤，主要是 自由基与细胞膜上丰富的不饱和脂肪酸反应， 形成脂质过氧化物（即LPO）而影响膜的正 常功能。
LPO（TBA法）
不饱和脂肪酸+活性氧→LPO
PH=4,△
硫代巴比妥酸(TBA) +丙二醛(MDA ) 红色产物 荧光法
灵敏度提高了10倍以上
比色法
激发波长为515 nm，荧光 波长为553 nm
总结
• 此法的优点是操作简便、 快速、 方便且重 复性好 , 可在单细胞水平对细胞内自由基进 行定位定量的动态监测 , 因此这一方法最近 发展最为迅速。 • 但该方法目前尚未完全成熟及标准化
荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、 荧光分光光度计或荧光酶标仪
2、荧光光度法
• 用荧光光度法来检测自由基的含量时 , 使用 的捕获剂在捕获自由基后会发生荧光强度 的变化。
• 可用来检测 ·OH 和LPO
· OH
• 荧光光度法是利用· OH极强的氧化性,诱导底物发 光或减弱底物发光强度,通过测量发光强度来测定 · OH浓度。 • 在常见的捕获剂中 , 荧光强度减弱的捕获剂有 Ce3+、 罗丹明 6G、 水杨基荧光酮 、吖啶红等, 而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch 反应等 Hantzsch 反应 · OH+ DMSO →甲醛 甲醛+乙酰丙酮+氨→3 ,5-二乙酰-1 ,4-二氢吡啶
鲁米诺
单价阴离子+自由基
催化剂 基态 两价阴离子氨基肽酸盐(APD) （激发态）
非辐射性跃迁
中性溶液
NO+ H2O2 过氧硝酸盐+鲁米诺
过氧硝酸盐 发光
化学发光测量一氧化氮简便灵敏，灵敏度达到 ～ 1 × 10-13mol / L。
另一种化学发光法测NO 臭氧与一氧化氮反应速度极快，发光强大。 NO+O3→NO2· NO2· →NO2+h 发射的光线波长在660~900nm之间，与NO浓度成 正比 检测灵敏度高，甚至将硝酸盐及亚硝酸盐还原为一 氧化氮来检测
RH
激发波长 488 nm , 发射波长在530 nm左右 DHE +O2EB(溴化乙锭)
激发波长 488 nm , 发射波长在 610 或650 nm 左右 2-吡啶甲醛苯并噻唑啉只能被O-2氧化，而共存的双氧水
和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化， 所以探针试剂对O-2具有专一性。
自由基的检测
主要内容
自由基简介 自由基及其性质 自由基的产生与分类 自由基与机体损伤 自由基的清除 自由基的检测方法
自由基及其性质
1.自由基（free radical）
化学上也称为“游离基”，是指带有不成对（ 奇数）电子的原子、原子基团或分子。
2.自由基，具有高度活泼性，很容易夺取其他物质
的电子而转变为稳定状态。在化学上，这种现象 称为“氧化”。
3、极谱法
· OH+DMSO→甲醛 甲醛+乙酰乙酯+氨→3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢吡啶
在-1.09V（对饱和甘汞 电极）处有一灵敏的二 阶导数极谱峰。通过电 流变化可间接测定· OH 量。 此法灵敏度高、操作简 便。
反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高. 据此可以计算出酶活性大小
3、邻苯三酚自氧化法
325nm、 420nm
邻苯三酚
碱性
中间体A
O2
中间体B
H2O2
终产物
O22O2-+2H+ SOD O2+H2O2
分光光度法测GSH-Px
• 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）对防止体 内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其 活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位 时间内GSH减少的量来表示
· OH的其他检测方法
•高效液相色谱法（HPLC） •自动电位滴定法
•极谱法
自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法
顺磁共振波谱仪示意图
• 生物体内能直接用ESR技术检测研究的自
由基很少，因为体内绝大多数自由基的反
应活性非常高，半衰期很短，使其浓度很
低（10-8M- 10-10M），不能达到目前ESR
自由基的清除
• 机体内存在着一套内源性抗氧化防御系统 ，它可以维持体内自由基代谢的平衡，使 人体处于健康状态。
直接
•与产生反应性氧化物（ROS）所 必需的金属离子结合，从而抑制 ROS的生成。 •通过补充合成抗自由基酶的必需 元素，提高酶促系统的合成能力。
酶促系统
超氧化物歧化酶（SOD）歧化自由基O-2生成H2O2
乙酸盐基团
DCFH-DA
DAF-FMDA DAF-FMDA
DCFH-DA
白膜 蛋
细胞内酯酶
乙酸盐基团
DCFH
DAF-FM
NO
自由基 （ O2、 ·OH ） 2、7-二氯荧光素（DCF）
DAF-FM
激发波长为495nm，发射波长为515nm
激发波长为488nm,发射波长为525nm
DHR
+自由基 O2-、· OH
未成对电子
自由基在夺取正常分子的电 子后，该分子就变成另一个自 由基， 如此循环，就会引发连 续的氧化反应，最终对机体产 生重大影响！
自由基的产生与分类 机体生理活动产生
机体的新陈代谢需要由氧化反应产生的能量， 这些氧化反应就是自由基的重要来源。
内源性自由基的产生
自由基的分类 机体内的自由基主要分为氧自由基和 脂质自由基
荧光分析法
•wenku.baidu.com光探针法
•荧光光度法 激光诱导荧光成像法是目前惟一的· OH直 接检测方法,它是利用激光照射· OH使其发 出特征荧光,用特殊相机记录荧光密度,从而 测算被测分子基团浓度。
1、荧光探针法
原理：荧光探针法测定技术的核心是荧光 探针 , 探针本身应该没有荧光或只有很弱的 荧光 , 能很容易通过细胞膜 , 但在细胞或细 胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。 常用的荧光探针有 2 ,7-二氯荧光黄乙酰乙 酸 （DCFH-DA） 、3-氨基，4-氨甲基-2’， 7’- 荧光二乙酸酯（DAF-FMDA） 、双氢罗 丹明123 (DHR) 、 二氢乙锭( DHE) 等 可检测O2- 、 ·OH 和NO
2O-2+2H+
SOD O2+H2O2
H2O2可被过氧化氢酶（CAT）分解为H2O
2H2O2
CAT
2H2O+O2
谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）中的巯基能与活性 氧结合，终止脂类自由基（LPO）的生成。
自由基的检测方法
• 自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法
•
•
分光光度法
化学发光法
•
•
荧光分析法
光泽精
光泽精
+
+
- 线粒体内膜
单价光泽精自由基
但是在实际应 用中 , H2O2 的分解过程同 样会产生 O2自由基 , 可能 会影响结果的 准确性。
+ O2激发态分子 不稳定的中间产物 基态
• 总结
• 优点：化学发光法是一种简便、快速、灵敏的痕 量分析方法。对于成分简单的样品，通过标准曲 线法、标准加入法等可以直接对待测组分进行很 好的定量分析。 • 缺点：但是在进行复杂样品分析的时候，由于发 光体系的选择性很差，不能对待测组分很好的定 性，使其在实际应用中受到了很大限制。
总结 测量方便,高效,灵敏度高 但是,又因为它需要昂贵的设备并且反应 有很多的中间产物所以在自由基的准确 定量检测上,仍显不足。
2、自动电位滴定法
•以过量的Fe2+与羟基自由基 反应, 然后用重铬酸钾返滴剩 余的 Fe2+, 进而可以计算出羟 基自由基浓度。 •自动电位滴定法以铂电极为 指示电极, 双盐桥饱和甘汞电 极作为参比电极, 根据滴定过 程中化学计量点附近的电位突 跃来确定电位滴定终点
• 根据消退速度和峰值改变程度可了解反应系统中自由
基清除剂的反应速度和能力。
• 简单、快速
• 总结
• 灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。 对于复杂的组分系统，无须分离即可检测 出其中所含的微量组分的特点。 • 仪器价格低廉易于被一般实验室所采用。 • 但测定过程中的干扰因素较多,容易对测定 的准确性和灵敏度造成影响。
· OH的其他检测方法
• 高效液相色谱法（HPLC） • 自动电位滴定法 • 极谱法
1、高效液相色谱法（HPLC）
HPLC法测定需要先用捕捉剂捕获自 由基，捕捉剂应能与自由基反应形成 稳定的结合物，且易于分离与检测。
• · OH • 常用的捕获剂安息香酸/水杨酸(SA)、二甲 亚砜(DMSO)
分光光度法
• 基本原理 利用自由基使显色剂发生颜色变化 , 根据 吸光度的变化值而间接测得自由基的含量
• 应用 ·OH、O2-、NO、SOD、CAT、GSH-Px、自 由基清除能力的测定
分光光度法检测·OH
分光光度法检测O2-
分光光度法检测NO
分光光度法检测CAT
2H2O2
CAT
2H2O+O2
自由基与机体损伤
在受控情况下对机体是有益的,也是必需的 自由基是能量传递的搬运工。 自由基可以帮助杀灭细菌、病毒和寄生虫 ，还能参与排除毒素。 信使分子。
体系中残留的过氧化氢再与钼酸胺作用生成黄色复 合物,其呈色的深浅可用分光光度计进行测定
分光光度法检测SOD
1、细胞色素C还原法
SOD
歧化 O-2
黄嘌呤-黄嘌呤氧化 酶体系
氧化型细胞色素C
还原型细胞色素C 550nm
2、氯化硝基四唑氮蓝 （NBT）还原法
SOD NBT
清除 O-2 二甲臜 560nm
2.导致免疫系统功能紊乱 *自由基抑制淋巴细胞的增生分化，抑制其对刺激 原的反应性； *改变K细胞和NK细胞的结构及功能，使其对靶细胞 的识别能力减弱； *被自由基损伤的部分细胞自动修复，而修复后的 细胞具有了抗原性，干扰正常的免疫功能。 3.损伤基因，导致DNA变异 自由基可使DNA断裂或交联，从而诱发基因突 变或癌变。
技术的检测水平（10-6M -10-7M）
• 解决这一困难的重要方法之一是自由基捕
获技术
自由基(自旋)捕获反应 . R∗ + ST → R-SA∗
自由基
自旋捕获剂 (一般为抗磁 性物质 )
自由基加合物 （radical adduct, 长寿命自由基）
使自由基加合物的浓度积累到能被ESR检 测到的水平
自由基捕获剂
通用自旋捕获剂
特异自旋捕获剂
亚硝基化合物 或氮氧化合物
NO
O-2·
· OH
血红蛋白 N-甲基葡萄糖胺-铁 复合物（MGD）
1，2-二羟基苯-3， 5-二磺酸钠(Tiron) 5, 5-二甲基1-吡咯 啉N-氧化物(DMPO)
• 总结
优点
可在室温下进行检测，解决了生理条件下 水溶液中寿命极其短暂的自由基的定性和 定量问题。 缺点 有些自旋捕集剂对生物体有毒,有些易受到 血脑屏障限制,无法到达自由基生成的组织 部位; 被捕获的自由基不专一,而且ESR法难以清 晰的解释被捕获的自由基种类,需要待测自 由基的清除剂加以佐证; 仪器成本较高
化学发光法
回到 基态
释放能量 自由基
电子激发
吸收能量
发光剂
化学发光测试仪示意图
常用的发光试剂鲁米诺（氨基苯二酰 一肼）和光泽精（N，N二甲基二吖啶 硝酸盐）
鲁米诺（O-2、· OH、LPO、 NO ）
PH=10
酶 , Fe2 +, Co2 +, Ni2 +和 Cu2 +等过 渡金属离子或者 金属络合物
滴定过程中的主要反应式: H++Fe2++· OH→Fe3++H2O Cr2O72-+6Fe2++14H+→6Fe3++2Cr3++7H2O
• 总结 • 自动电位滴定由于不受指示剂以及人为判 断滴定终点的影响，操作过程中误差小， 分析结果准确度高、稳定性好。
• 该方法终点判断简单、操作简单、测定快 速、成本低廉，可作为一种简便易行的测 定羟自由基浓度的方法。
GSH-Px GSH+5,5’-DTNB 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子
二硫对硝基苯甲酸 于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算 出GSH减少的量
分光光度法检测自由基清除能力 (DPPH)
• DPPH・是一种稳定的自由基,其醇溶液呈深紫色,在
517nm处有一吸收峰。 • 当反应系统中存在自由基清除剂时,它可以和DPPH・ 的单电子配对而使517nm处的吸收峰渐渐消退。
*NO作为信使分子， 作用于平滑肌，使 血管扩张 硝酸甘油
自由基的危害
自由基过量，并失控时，机体的正常秩序就会被 破坏，并因此产生多种疾病。 自由基的损伤机理 1.损伤细胞膜结构 2.导致免疫系统功能紊 乱 3.损伤基因，导致DNA 变异
1.损伤细胞膜结构 自由基对细胞膜结构的损伤，主要是 自由基与细胞膜上丰富的不饱和脂肪酸反应， 形成脂质过氧化物（即LPO）而影响膜的正 常功能。
LPO（TBA法）
不饱和脂肪酸+活性氧→LPO
PH=4,△
硫代巴比妥酸(TBA) +丙二醛(MDA ) 红色产物 荧光法
灵敏度提高了10倍以上
比色法
激发波长为515 nm，荧光 波长为553 nm
总结
• 此法的优点是操作简便、 快速、 方便且重 复性好 , 可在单细胞水平对细胞内自由基进 行定位定量的动态监测 , 因此这一方法最近 发展最为迅速。 • 但该方法目前尚未完全成熟及标准化
荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、 荧光分光光度计或荧光酶标仪
2、荧光光度法
• 用荧光光度法来检测自由基的含量时 , 使用 的捕获剂在捕获自由基后会发生荧光强度 的变化。
• 可用来检测 ·OH 和LPO
· OH
• 荧光光度法是利用· OH极强的氧化性,诱导底物发 光或减弱底物发光强度,通过测量发光强度来测定 · OH浓度。 • 在常见的捕获剂中 , 荧光强度减弱的捕获剂有 Ce3+、 罗丹明 6G、 水杨基荧光酮 、吖啶红等, 而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch 反应等 Hantzsch 反应 · OH+ DMSO →甲醛 甲醛+乙酰丙酮+氨→3 ,5-二乙酰-1 ,4-二氢吡啶
鲁米诺
单价阴离子+自由基
催化剂 基态 两价阴离子氨基肽酸盐(APD) （激发态）
非辐射性跃迁
中性溶液
NO+ H2O2 过氧硝酸盐+鲁米诺
过氧硝酸盐 发光
化学发光测量一氧化氮简便灵敏，灵敏度达到 ～ 1 × 10-13mol / L。
另一种化学发光法测NO 臭氧与一氧化氮反应速度极快，发光强大。 NO+O3→NO2· NO2· →NO2+h 发射的光线波长在660~900nm之间，与NO浓度成 正比 检测灵敏度高，甚至将硝酸盐及亚硝酸盐还原为一 氧化氮来检测
RH
激发波长 488 nm , 发射波长在530 nm左右 DHE +O2EB(溴化乙锭)
激发波长 488 nm , 发射波长在 610 或650 nm 左右 2-吡啶甲醛苯并噻唑啉只能被O-2氧化，而共存的双氧水
和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化， 所以探针试剂对O-2具有专一性。
自由基的检测
主要内容
自由基简介 自由基及其性质 自由基的产生与分类 自由基与机体损伤 自由基的清除 自由基的检测方法
自由基及其性质
1.自由基（free radical）
化学上也称为“游离基”，是指带有不成对（ 奇数）电子的原子、原子基团或分子。
2.自由基，具有高度活泼性，很容易夺取其他物质
的电子而转变为稳定状态。在化学上，这种现象 称为“氧化”。
3、极谱法
· OH+DMSO→甲醛 甲醛+乙酰乙酯+氨→3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢吡啶
在-1.09V（对饱和甘汞 电极）处有一灵敏的二 阶导数极谱峰。通过电 流变化可间接测定· OH 量。 此法灵敏度高、操作简 便。
反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反 之酶活性愈高. 据此可以计算出酶活性大小
3、邻苯三酚自氧化法
325nm、 420nm
邻苯三酚
碱性
中间体A
O2
中间体B
H2O2
终产物
O22O2-+2H+ SOD O2+H2O2
分光光度法测GSH-Px
• 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）对防止体 内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其 活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位 时间内GSH减少的量来表示
· OH的其他检测方法
•高效液相色谱法（HPLC） •自动电位滴定法
•极谱法
自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法
顺磁共振波谱仪示意图
• 生物体内能直接用ESR技术检测研究的自
由基很少，因为体内绝大多数自由基的反
应活性非常高，半衰期很短，使其浓度很
低（10-8M- 10-10M），不能达到目前ESR
自由基的清除
• 机体内存在着一套内源性抗氧化防御系统 ，它可以维持体内自由基代谢的平衡，使 人体处于健康状态。
直接
•与产生反应性氧化物（ROS）所 必需的金属离子结合，从而抑制 ROS的生成。 •通过补充合成抗自由基酶的必需 元素，提高酶促系统的合成能力。
酶促系统
超氧化物歧化酶（SOD）歧化自由基O-2生成H2O2
乙酸盐基团
DCFH-DA
DAF-FMDA DAF-FMDA
DCFH-DA
白膜 蛋
细胞内酯酶
乙酸盐基团
DCFH
DAF-FM
NO
自由基 （ O2、 ·OH ） 2、7-二氯荧光素（DCF）
DAF-FM
激发波长为495nm，发射波长为515nm
激发波长为488nm,发射波长为525nm
DHR
+自由基 O2-、· OH
未成对电子
自由基在夺取正常分子的电 子后，该分子就变成另一个自 由基， 如此循环，就会引发连 续的氧化反应，最终对机体产 生重大影响！
自由基的产生与分类 机体生理活动产生
机体的新陈代谢需要由氧化反应产生的能量， 这些氧化反应就是自由基的重要来源。
内源性自由基的产生
自由基的分类 机体内的自由基主要分为氧自由基和 脂质自由基
荧光分析法
•wenku.baidu.com光探针法
•荧光光度法 激光诱导荧光成像法是目前惟一的· OH直 接检测方法,它是利用激光照射· OH使其发 出特征荧光,用特殊相机记录荧光密度,从而 测算被测分子基团浓度。
1、荧光探针法
原理：荧光探针法测定技术的核心是荧光 探针 , 探针本身应该没有荧光或只有很弱的 荧光 , 能很容易通过细胞膜 , 但在细胞或细 胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。 常用的荧光探针有 2 ,7-二氯荧光黄乙酰乙 酸 （DCFH-DA） 、3-氨基，4-氨甲基-2’， 7’- 荧光二乙酸酯（DAF-FMDA） 、双氢罗 丹明123 (DHR) 、 二氢乙锭( DHE) 等 可检测O2- 、 ·OH 和NO
2O-2+2H+
SOD O2+H2O2
H2O2可被过氧化氢酶（CAT）分解为H2O
2H2O2
CAT
2H2O+O2
谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）中的巯基能与活性 氧结合，终止脂类自由基（LPO）的生成。
自由基的检测方法
• 自旋共振波谱仪(ESR)自旋捕获法
•
•
分光光度法
化学发光法
•
•
荧光分析法
光泽精
光泽精
+
+
- 线粒体内膜
单价光泽精自由基
但是在实际应 用中 , H2O2 的分解过程同 样会产生 O2自由基 , 可能 会影响结果的 准确性。
+ O2激发态分子 不稳定的中间产物 基态
• 总结
• 优点：化学发光法是一种简便、快速、灵敏的痕 量分析方法。对于成分简单的样品，通过标准曲 线法、标准加入法等可以直接对待测组分进行很 好的定量分析。 • 缺点：但是在进行复杂样品分析的时候，由于发 光体系的选择性很差，不能对待测组分很好的定 性，使其在实际应用中受到了很大限制。
总结 测量方便,高效,灵敏度高 但是,又因为它需要昂贵的设备并且反应 有很多的中间产物所以在自由基的准确 定量检测上,仍显不足。
2、自动电位滴定法
•以过量的Fe2+与羟基自由基 反应, 然后用重铬酸钾返滴剩 余的 Fe2+, 进而可以计算出羟 基自由基浓度。 •自动电位滴定法以铂电极为 指示电极, 双盐桥饱和甘汞电 极作为参比电极, 根据滴定过 程中化学计量点附近的电位突 跃来确定电位滴定终点
• 根据消退速度和峰值改变程度可了解反应系统中自由
基清除剂的反应速度和能力。
• 简单、快速
• 总结
• 灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。 对于复杂的组分系统，无须分离即可检测 出其中所含的微量组分的特点。 • 仪器价格低廉易于被一般实验室所采用。 • 但测定过程中的干扰因素较多,容易对测定 的准确性和灵敏度造成影响。
· OH的其他检测方法
• 高效液相色谱法（HPLC） • 自动电位滴定法 • 极谱法
1、高效液相色谱法（HPLC）
HPLC法测定需要先用捕捉剂捕获自 由基，捕捉剂应能与自由基反应形成 稳定的结合物，且易于分离与检测。
• · OH • 常用的捕获剂安息香酸/水杨酸(SA)、二甲 亚砜(DMSO)
分光光度法
• 基本原理 利用自由基使显色剂发生颜色变化 , 根据 吸光度的变化值而间接测得自由基的含量
• 应用 ·OH、O2-、NO、SOD、CAT、GSH-Px、自 由基清除能力的测定
分光光度法检测·OH
分光光度法检测O2-
分光光度法检测NO
分光光度法检测CAT
2H2O2
CAT
2H2O+O2