L_苏氨酸发酵过程中乙酸的控制
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发酵结束后， 将发酵液体积还原至初始发酵 体积， 以排除发酵过程中水分蒸发对产物浓度的 影响。
氨基酸测定：Agilent 1200 高效液相色谱仪柱 前衍生分析测定。
乙酸测定：Agilent1200 高效液相色谱仪分析 测定。 1.3 发酵培养条件的探索 1.3.1 氮源对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累的 影响
Abstract:Escherichia coli is a widely used host strain for expressing foreign genes. But a significant portion of the metabolic flux is channeled to acetic acid, which is a undesired byproduct in the culture period. Except for consuming a lot of carbon source, acetate can inhibit cell growth and is detrimental to recombinant protein production. In this study, we utilized a strain of Escherichia coli to produce L-threonine. In order to improve the yield of L-threonine, we restrain the production of acetic acid through choosing suitable fermentation conditions. The initial output of L-threonine was 0.09 g/L, while the optimized output was 2.06 g/L.
Key words：Escherichia coli L-threonine acetic acid Fermentation
L-苏 氨 酸 （Threonine）化 学 名 称 为 α-氨 基β-羟基 丁 酸 ，1935 年 由 W.C.Rose 在 纤 维 蛋 白 水 解物中分离和鉴定出来。1936 年，Meger 对它的空 间结构进行了研究，因其结构与苏糖相似，故将其 命名为苏氨酸[1]。 L-苏氨酸是人与动物体内所必 需的一种氨基酸，自身不能合成，必须从食物中摄 取[2]。 L-苏氨酸具有恢复体力、促进生长发育、催 眠 和 镇 静 效 果 [3]， 作 为 食 品 添 加 剂 ， 广 泛 应 用 于 饲 料工业、保健食品和医药工业。
0.01 0.18 0.14 0.25
0.00 0.03 0.09 0.52
乙酸 /(g/L) 9.1
5.4
2.2 接种量对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累的 影响
在大肠杆菌发酵生产 L-苏氨酸的过程中，乙 酸的形成与 TCA 循环的有限能力有关。 在低比生 长速率时，TCA 循环可满足合成和分解代谢的需 求，但在较高比生长速率时，这两者的需求将超过 细胞本身所具有的 TCA 循环能力。 大肠杆菌在这 样的条件下将由 TCA 循环和乙酸形成代谢共 同 满足代谢的能量需求[10]。
发酵科技通讯
第 41 卷
L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制
胡 丹 周希贵 胡炎华 李 岩 （梅花生物科技集团股份有限公司 河北廊坊 065001）
摘 要：大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主菌，然而在培养过程中容易发生副产物乙酸的积累， 不仅造成碳源的浪费，而且严重抑制菌体生长及外源基因的表达。本研究利用一株自主构建的大肠杆菌 基因工程菌（MHZ0200-2）发酵生产 L-苏氨酸。 通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成， 从而提高 L-苏氨酸的产量。 L-苏氨酸的初始产量是 0.09g/L，培养条件优化后产量提高到 2.06g/L。
微生物发酵中， 氮源主要用于构成菌体细胞 和含氮目的产物， 同时为菌体生长提供必需的生 长因子。
实验选取苏氨酸发酵中最常用的两种氮源硫 酸铵和豆粕水解液， 研究比较二者在苏氨酸发酵 过程中对大肠杆菌积累乙酸的影响。 其添加量都 为 10 g/L，其它培养基成分同基础发酵培养基。 1.3.2 接种量对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累 的影响
大肠杆菌好气培养时， 氧气分子是电子传递 最终受体。 随着细胞生长，氧消耗不断增加，摇瓶 培养极易发生供氧不足， 而缺氧时乙酸积累迅速 增 加 [9]。
本实验中溶氧的改变主要通过两种方式：一 是摇床振荡方式：回转式、往复式；二是摇瓶装液 量：10ml/200ml 三角瓶、10ml/500ml 三角瓶。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株来源
大肠杆菌 MHZ0200-2 为本公司自主构建的 基因工Leabharlann Baidu菌株。 该菌株以大肠杆菌 W3110 为出发 菌株，含有带定点突变的苏氨酸启动子，同时缺失 高丝氨酸转琥珀酰酶和苏氨酸脱氢酶的编码基 因。 其构建过程如下： 1.1.1.1 W3110（pKK223-3-thrA' BC）的制备：提 取大肠杆菌 W3110 基因组做为模板，设计引物扩 增苏氨酸操纵子 thrABC， 使用重叠延伸 PCR 的 方法进行 thrA（编码天冬氨酸激酶）的定点突变， 将 thrA 的 1034 位碱基由 C 变为 T， 相应的氨基 酸由丝氨酸变为苯丙氨酸，解除 L-苏氨酸对天冬 氨 酸 激 酶 的 反 馈 抑 制 。 将 thrA ' BC 构 建 至 pKK223-3，形成新的质粒 pKK223-3-thrA' BC， 转化至大肠杆菌 W3110，从而获得解除 L-苏氨酸 反馈抑制的基因工程菌。 1.1.1.2 W3110△metA 的制备： 利用 red 重组系 统敲除 metA。 大肠杆菌 W3110 转入 pKD46 获得 新 菌 WpKD。 制 备 WpKD 的 感 受 态 。 培 养 温 度 30℃，OD600 达 到 0.2 左 右 时 加 入 L-阿 拉 伯 糖 ，其 终浓度 100mol，继续培养至 OD600 达到 0.5~0.6 时 制作感受态。 感受态 WpKD 转入带有同源臂的抗 性片段形成 W3110△metA：：cat/kan，并制作感受 态细胞， 之后转入 pCP20，42℃诱导，37℃划线挑 单菌 PCR 及抗性验证，以测序结果为基准，获得 W3110△metA。 1.1.1.3 在 W3110△metA 的 基 础 上 制 备 W3110 △metA △tdh， 其 制 备 过 程 同 上 述 。 之 后 转 入 W3110 （pKK223-3-thrA' BC）， 获 得 最 终 菌 株 W3110 -pKT -Δ （metA）Δ （tdh） （pKK223 -3 -thrA’ BC），并自主命名为 MHZ0200-2。 1.1.2 仪器与试剂
种 子 培 养 基 （g/L）：葡 萄 糖 25，硫 酸 铵 10，玉 米浆 20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01；pH7.0。
培 养 条 件 ：37℃、220rpm 回 转 摇 床 振 荡 培 养 5h~6 h。 （实验初期已构建菌株的生长曲线，该菌 株约在 5h~6 h 进入对数生长期，此时 OD600（20×） ≈0.18。 1.2.2 发酵培养
实验选取 4 种不同的接种量：1%、5%、10%、 15%，研究其对乙酸和 L-苏氨酸合成的影响。 1.3.3 天冬氨酸对 L-苏氨酸生成和乙酸积累的 影响
L-苏氨酸是天冬氨酸家族氨基酸，前体物 L天冬氨酸的缺乏或丰富，对 L-苏氨酸的积累有直 接影响。
本研究通过在发酵培养基中添加不同浓度的 前体 L-天冬氨酸，研究 L-天冬氨酸对 L-苏氨酸 合成和乙酸积累的影响。 1.3.4 不同碳源对 L-苏氨酸生成和乙酸积累的 影响
2 结果与讨论
2.1 氮源对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累的影 响
在其他条件均相同仅改变氮源的条件下，不 同发酵液的分析结果差异明显，如表 1 所示。当以 豆粕水解液为氮源，与以硫酸铵为氮源相比较，前 者乙酸的积累明显下降，从 9.1g/L 降低到 5.4g/L。 同时，L-苏氨酸的产量有明显提高，从 0.25g/L 提 高到 0.52g/L。 并且，生成的其它游离氨基酸的种 类和含量也很少。
脉动真空灭菌柜，张家港神农药机有限公司； 双人超净工作台，苏州净化设备厂；DHZ-CA 型回 转式摇床， 太仓市实验设备厂；DHZ-DA 型往复
式摇床， 太仓市实验设备厂；V-1800 型可见分光 光度计，上海美谱达仪器有限公司；高效液相色谱 仪，Agilent1200。 玉米浆 和 豆 粕 水 解 液 为 公 司 自 产，其它所用试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 种子培养
从实验得知，以豆粕水解液为氮源明显优于硫 酸铵。前者可以有效控制副产物乙酸和其它游离氨
—6—
基酸的生成，同时提高了 L-苏氨酸的积累量。 表 1 氮源对 L-苏氨酸发酵过程中 乙酸积累的影响
氮源
硫酸铵 豆粕水
解液
产物含量 甘氨酸 丙氨酸 精氨酸 苏氨酸 /(g/L) /(g/L) /(g/L) /(g/L)
本研究利用一株自主构建的大肠杆菌基因工 程菌 MHZ0200-2 摇瓶发酵生产 L-苏氨酸。 该菌
第 41 卷第 4 期 2012 年 10 月
发酵科技通讯
株构建初始摇瓶发酵合成 L-苏氨酸的量仅为 0.06 g/L。 本研究的目的在于，通过改变摇瓶培养 条件，探索适合该菌株积累 L-苏氨酸、同时抑制 其主要副产物乙酸生成的培养条件， 从而达到提 高 L-苏氨酸产量的目的。
基 础 发 酵 培 养 基 （g/L）： 葡 萄 糖 30， 硫 酸 铵 10，玉米浆 6，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4· 7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01；pH7.0。
培 养 条 件 ：37℃、220rpm 回 转 摇 床 振 荡 培 养 48 h。 1.2.3 产物检测
关键词：大肠杆菌 L-苏氨酸 乙酸 发酵
Study on Acetic Acid Controlling on L-Threoinine Fermentation
Hu Dan Zhou Xigui Hu Yanhua Li Yan (Meihua Holdings Group, Langfang 065001, Hebei, China)
大肠杆菌在培养过程中， 乙酸的积累主要与 葡萄糖效应有关，当以其它碳源代替葡萄糖，可以 有效降低乙酸的积累。
实验选取三种不同的碳源：蔗糖、葡萄糖和甘 油，比较不同碳源对大肠杆菌发酵过程中 L-苏氨 酸合成和乙酸积累的影响。 三种碳源的添加量均 为 30g/L，其它培养基成分同基础发酵培养基。 1.3.5 溶氧对 L-苏氨酸生成和乙酸积累的影响
菌体浓度对乙酸的生成有直接影响。 当菌体 浓度过大， 耗氧量增加， 容易导致乙酸的过快生 成。 当菌体浓度过低， 又会降低目的产物的合成 量。 因此，通过选择合适的接种量，可以在发酵前
—5—
发酵科技通讯
第 41 卷
期控制发酵液中的菌体浓度， 延缓大肠杆菌的呼 吸受限作用，从而控制乙酸的过快生成，提高 L苏氨酸产率。
微生物发酵法是目前 L-苏氨酸工业化生产 的主流方法[4]。 L-苏氨酸的主要生产菌株有谷氨 酸棒杆菌、黄色短杆菌和大肠杆菌[5]。 大肠杆菌由 于其繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究比
—4—
较深入等特征，成为 L-苏氨酸生产的最常用菌株[6]。 大肠杆菌作为 L-苏氨酸生产菌， 在发酵产生 L苏氨酸的同时，还会生成乙酸、丙氨酸、缬氨酸和 精氨酸等代谢副产物， 在一定程度上影响菌体生 长及 L-苏氨酸的合成与积累[7]。 其中，乙酸的抑制 效果尤为明显。当乙酸积累到一定浓度时，菌体的 比生长速率迅速下降，产物合成大大降低，并形成 恶性循环，同时外源基因的表达也受到严重影响。 乙酸积累对细胞代谢造成的不利影响， 是利用大 肠杆菌作为宿主菌表达外源蛋白的一个不可忽视 的 问 题 [8]。
氨基酸测定：Agilent 1200 高效液相色谱仪柱 前衍生分析测定。
乙酸测定：Agilent1200 高效液相色谱仪分析 测定。 1.3 发酵培养条件的探索 1.3.1 氮源对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累的 影响
Abstract:Escherichia coli is a widely used host strain for expressing foreign genes. But a significant portion of the metabolic flux is channeled to acetic acid, which is a undesired byproduct in the culture period. Except for consuming a lot of carbon source, acetate can inhibit cell growth and is detrimental to recombinant protein production. In this study, we utilized a strain of Escherichia coli to produce L-threonine. In order to improve the yield of L-threonine, we restrain the production of acetic acid through choosing suitable fermentation conditions. The initial output of L-threonine was 0.09 g/L, while the optimized output was 2.06 g/L.
Key words：Escherichia coli L-threonine acetic acid Fermentation
L-苏 氨 酸 （Threonine）化 学 名 称 为 α-氨 基β-羟基 丁 酸 ，1935 年 由 W.C.Rose 在 纤 维 蛋 白 水 解物中分离和鉴定出来。1936 年，Meger 对它的空 间结构进行了研究，因其结构与苏糖相似，故将其 命名为苏氨酸[1]。 L-苏氨酸是人与动物体内所必 需的一种氨基酸，自身不能合成，必须从食物中摄 取[2]。 L-苏氨酸具有恢复体力、促进生长发育、催 眠 和 镇 静 效 果 [3]， 作 为 食 品 添 加 剂 ， 广 泛 应 用 于 饲 料工业、保健食品和医药工业。
0.01 0.18 0.14 0.25
0.00 0.03 0.09 0.52
乙酸 /(g/L) 9.1
5.4
2.2 接种量对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累的 影响
在大肠杆菌发酵生产 L-苏氨酸的过程中，乙 酸的形成与 TCA 循环的有限能力有关。 在低比生 长速率时，TCA 循环可满足合成和分解代谢的需 求，但在较高比生长速率时，这两者的需求将超过 细胞本身所具有的 TCA 循环能力。 大肠杆菌在这 样的条件下将由 TCA 循环和乙酸形成代谢共 同 满足代谢的能量需求[10]。
发酵科技通讯
第 41 卷
L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制
胡 丹 周希贵 胡炎华 李 岩 （梅花生物科技集团股份有限公司 河北廊坊 065001）
摘 要：大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主菌，然而在培养过程中容易发生副产物乙酸的积累， 不仅造成碳源的浪费，而且严重抑制菌体生长及外源基因的表达。本研究利用一株自主构建的大肠杆菌 基因工程菌（MHZ0200-2）发酵生产 L-苏氨酸。 通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成， 从而提高 L-苏氨酸的产量。 L-苏氨酸的初始产量是 0.09g/L，培养条件优化后产量提高到 2.06g/L。
微生物发酵中， 氮源主要用于构成菌体细胞 和含氮目的产物， 同时为菌体生长提供必需的生 长因子。
实验选取苏氨酸发酵中最常用的两种氮源硫 酸铵和豆粕水解液， 研究比较二者在苏氨酸发酵 过程中对大肠杆菌积累乙酸的影响。 其添加量都 为 10 g/L，其它培养基成分同基础发酵培养基。 1.3.2 接种量对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累 的影响
大肠杆菌好气培养时， 氧气分子是电子传递 最终受体。 随着细胞生长，氧消耗不断增加，摇瓶 培养极易发生供氧不足， 而缺氧时乙酸积累迅速 增 加 [9]。
本实验中溶氧的改变主要通过两种方式：一 是摇床振荡方式：回转式、往复式；二是摇瓶装液 量：10ml/200ml 三角瓶、10ml/500ml 三角瓶。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株来源
大肠杆菌 MHZ0200-2 为本公司自主构建的 基因工Leabharlann Baidu菌株。 该菌株以大肠杆菌 W3110 为出发 菌株，含有带定点突变的苏氨酸启动子，同时缺失 高丝氨酸转琥珀酰酶和苏氨酸脱氢酶的编码基 因。 其构建过程如下： 1.1.1.1 W3110（pKK223-3-thrA' BC）的制备：提 取大肠杆菌 W3110 基因组做为模板，设计引物扩 增苏氨酸操纵子 thrABC， 使用重叠延伸 PCR 的 方法进行 thrA（编码天冬氨酸激酶）的定点突变， 将 thrA 的 1034 位碱基由 C 变为 T， 相应的氨基 酸由丝氨酸变为苯丙氨酸，解除 L-苏氨酸对天冬 氨 酸 激 酶 的 反 馈 抑 制 。 将 thrA ' BC 构 建 至 pKK223-3，形成新的质粒 pKK223-3-thrA' BC， 转化至大肠杆菌 W3110，从而获得解除 L-苏氨酸 反馈抑制的基因工程菌。 1.1.1.2 W3110△metA 的制备： 利用 red 重组系 统敲除 metA。 大肠杆菌 W3110 转入 pKD46 获得 新 菌 WpKD。 制 备 WpKD 的 感 受 态 。 培 养 温 度 30℃，OD600 达 到 0.2 左 右 时 加 入 L-阿 拉 伯 糖 ，其 终浓度 100mol，继续培养至 OD600 达到 0.5~0.6 时 制作感受态。 感受态 WpKD 转入带有同源臂的抗 性片段形成 W3110△metA：：cat/kan，并制作感受 态细胞， 之后转入 pCP20，42℃诱导，37℃划线挑 单菌 PCR 及抗性验证，以测序结果为基准，获得 W3110△metA。 1.1.1.3 在 W3110△metA 的 基 础 上 制 备 W3110 △metA △tdh， 其 制 备 过 程 同 上 述 。 之 后 转 入 W3110 （pKK223-3-thrA' BC）， 获 得 最 终 菌 株 W3110 -pKT -Δ （metA）Δ （tdh） （pKK223 -3 -thrA’ BC），并自主命名为 MHZ0200-2。 1.1.2 仪器与试剂
种 子 培 养 基 （g/L）：葡 萄 糖 25，硫 酸 铵 10，玉 米浆 20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01；pH7.0。
培 养 条 件 ：37℃、220rpm 回 转 摇 床 振 荡 培 养 5h~6 h。 （实验初期已构建菌株的生长曲线，该菌 株约在 5h~6 h 进入对数生长期，此时 OD600（20×） ≈0.18。 1.2.2 发酵培养
实验选取 4 种不同的接种量：1%、5%、10%、 15%，研究其对乙酸和 L-苏氨酸合成的影响。 1.3.3 天冬氨酸对 L-苏氨酸生成和乙酸积累的 影响
L-苏氨酸是天冬氨酸家族氨基酸，前体物 L天冬氨酸的缺乏或丰富，对 L-苏氨酸的积累有直 接影响。
本研究通过在发酵培养基中添加不同浓度的 前体 L-天冬氨酸，研究 L-天冬氨酸对 L-苏氨酸 合成和乙酸积累的影响。 1.3.4 不同碳源对 L-苏氨酸生成和乙酸积累的 影响
2 结果与讨论
2.1 氮源对 L-苏氨酸发酵过程中乙酸积累的影 响
在其他条件均相同仅改变氮源的条件下，不 同发酵液的分析结果差异明显，如表 1 所示。当以 豆粕水解液为氮源，与以硫酸铵为氮源相比较，前 者乙酸的积累明显下降，从 9.1g/L 降低到 5.4g/L。 同时，L-苏氨酸的产量有明显提高，从 0.25g/L 提 高到 0.52g/L。 并且，生成的其它游离氨基酸的种 类和含量也很少。
脉动真空灭菌柜，张家港神农药机有限公司； 双人超净工作台，苏州净化设备厂；DHZ-CA 型回 转式摇床， 太仓市实验设备厂；DHZ-DA 型往复
式摇床， 太仓市实验设备厂；V-1800 型可见分光 光度计，上海美谱达仪器有限公司；高效液相色谱 仪，Agilent1200。 玉米浆 和 豆 粕 水 解 液 为 公 司 自 产，其它所用试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 种子培养
从实验得知，以豆粕水解液为氮源明显优于硫 酸铵。前者可以有效控制副产物乙酸和其它游离氨
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基酸的生成，同时提高了 L-苏氨酸的积累量。 表 1 氮源对 L-苏氨酸发酵过程中 乙酸积累的影响
氮源
硫酸铵 豆粕水
解液
产物含量 甘氨酸 丙氨酸 精氨酸 苏氨酸 /(g/L) /(g/L) /(g/L) /(g/L)
本研究利用一株自主构建的大肠杆菌基因工 程菌 MHZ0200-2 摇瓶发酵生产 L-苏氨酸。 该菌
第 41 卷第 4 期 2012 年 10 月
发酵科技通讯
株构建初始摇瓶发酵合成 L-苏氨酸的量仅为 0.06 g/L。 本研究的目的在于，通过改变摇瓶培养 条件，探索适合该菌株积累 L-苏氨酸、同时抑制 其主要副产物乙酸生成的培养条件， 从而达到提 高 L-苏氨酸产量的目的。
基 础 发 酵 培 养 基 （g/L）： 葡 萄 糖 30， 硫 酸 铵 10，玉米浆 6，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4· 7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01；pH7.0。
培 养 条 件 ：37℃、220rpm 回 转 摇 床 振 荡 培 养 48 h。 1.2.3 产物检测
关键词：大肠杆菌 L-苏氨酸 乙酸 发酵
Study on Acetic Acid Controlling on L-Threoinine Fermentation
Hu Dan Zhou Xigui Hu Yanhua Li Yan (Meihua Holdings Group, Langfang 065001, Hebei, China)
大肠杆菌在培养过程中， 乙酸的积累主要与 葡萄糖效应有关，当以其它碳源代替葡萄糖，可以 有效降低乙酸的积累。
实验选取三种不同的碳源：蔗糖、葡萄糖和甘 油，比较不同碳源对大肠杆菌发酵过程中 L-苏氨 酸合成和乙酸积累的影响。 三种碳源的添加量均 为 30g/L，其它培养基成分同基础发酵培养基。 1.3.5 溶氧对 L-苏氨酸生成和乙酸积累的影响
菌体浓度对乙酸的生成有直接影响。 当菌体 浓度过大， 耗氧量增加， 容易导致乙酸的过快生 成。 当菌体浓度过低， 又会降低目的产物的合成 量。 因此，通过选择合适的接种量，可以在发酵前
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发酵科技通讯
第 41 卷
期控制发酵液中的菌体浓度， 延缓大肠杆菌的呼 吸受限作用，从而控制乙酸的过快生成，提高 L苏氨酸产率。
微生物发酵法是目前 L-苏氨酸工业化生产 的主流方法[4]。 L-苏氨酸的主要生产菌株有谷氨 酸棒杆菌、黄色短杆菌和大肠杆菌[5]。 大肠杆菌由 于其繁殖迅速、发酵温度高、生理生化基础研究比
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较深入等特征，成为 L-苏氨酸生产的最常用菌株[6]。 大肠杆菌作为 L-苏氨酸生产菌， 在发酵产生 L苏氨酸的同时，还会生成乙酸、丙氨酸、缬氨酸和 精氨酸等代谢副产物， 在一定程度上影响菌体生 长及 L-苏氨酸的合成与积累[7]。 其中，乙酸的抑制 效果尤为明显。当乙酸积累到一定浓度时，菌体的 比生长速率迅速下降，产物合成大大降低，并形成 恶性循环，同时外源基因的表达也受到严重影响。 乙酸积累对细胞代谢造成的不利影响， 是利用大 肠杆菌作为宿主菌表达外源蛋白的一个不可忽视 的 问 题 [8]。