苏氨酸综述

苏氨酸背景
苏氨酸，学名为2-氨基-3-羟基丁酸。

是一种含有一个醇式羟基的脂肪族α氨基酸。

其中，L-苏氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，有两个不对称碳原子，具有4种异构体。

是哺乳动物的必需氨基酸和生酮氨基酸。

它是由Mecoy在1935年于纤维蛋白水解物之中分离和鉴定出来的。

在人体和动物所需的8种必需氨基酸中，苏氨酸是仅次于蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸的第4种氨基酸．苏氨酸在人和动物的生长发育中发挥着重要作用，被广泛应用于饲养业、食品业以及医疗业等方面。

L-苏氨酸的生产方法有蛋白质水解法、化学合成法、直接发酵法和酶法。

蛋白质水解法和化学合成法因其存在种种弊端，工业化生产中已经基本不再使用．酶法生产L-苏氨酸具有专一性高、产品单一、易于精制的特点，但所需酶难以获得，制约了酶法的应用。

直接发酵法生产成本低、资源节约、环境污染小，是目前工业化生产L-苏氨酸的主要方式。

自1935年Rose等首次从血纤蛋白中分离到苏氨酸以来，苏氨酸的生产已取得了很大进展。

1950年代，日本的志村、植村2位教授采用添加前体物的方法发酵生产苏氨酸。

国外从1960年代就有开始采用直接发酵法生产L-苏氨酸的报道。

1970年代末，前苏联的研究者们运用基因工程菌规模生产。

世界上主要的苏氨酸生产企业有日本味之素公司、德国德固赛公司、美国ADM公司、日本协合发酵工业公司等。

国内从1982年才开始有L-苏氨酸产生菌选育的报道，黄和容等报道了以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)为出发菌株选育苏氨酸产生菌，产量为13g/L。

1986年，檀耀辉等报道以乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的出发菌株，选育出1株L-苏氨酸产生菌，在适宜条件下发酵72h可产酸16/L。

目前，国内外均采用基因工程菌进行生产，国外产酸水平为100 g/L左右，国内为80 g/L左右，糖酸转化率为30％-40%。

大肠杆菌L-苏氨酸高产的菌株的构建和表达
目前为止，大多数氨基酸生产菌株是通过随机诱变的方法发展提高的。

这种经典的方法已成功的运用于其他氨基酸生产菌，但它还存在一些问题。

通过诱变而改变的基因是随机分布的，其中有些区域与氨基酸的生物合成没有直接关系，从而对细胞生理机能造成不必要的更改。

通过高通量DNA测序使精确地识别改变的基因成为可能，但要理解它们对于细胞代谢和调控的影响仍然不容易。

因此，很难进一步提高这些随机突变株的性能。

为了避免这个问题，利用合理的代谢工程构建氨基酸生产菌株是首选。

系统代谢工程就是将全基因代谢工程和系统生物学结合起来。

利用现有的基因发明的最新研究和利用计算机对其他组学技术已经分析可以帮助为我们在构建所需的高产菌株方面开启了一个新天地。

Kwang Ho Lee[1]等人利用系统代谢工程去除了分别编码天冬氨酸激酶I和III的thrA和lysC基因和位于thrL 的转录衰减现象。

通过删除tdh和突变ilvA基因使苏氨酸不会被降解。

删除metA和lysA基因可以合成更多苏氨酸生物合成所需的前体。

通过转录组图谱结合计算机代谢流响应分析，确定了需要进一步进行构造的目的基因。

最终得到的大肠杆菌菌株在分批发酵培养中的苏氨酸产量可高达0.393g/g，82.4 g/L。

工业发酵中蔗糖是一种很具有前景的碳源，为了可以让往不能利用蔗糖的菌株利用蔗糖，就需要向中导入蔗糖利用的操纵子。

Jeong Wook Lee[2]等人发现将M.succiniciproducens 的β-呋喃果糖苷酶导入大肠杆菌K-12中最有利于蔗糖的利用。

在胞外蔗糖水解成葡萄糖和果糖，然后被输送进入当场赶紧K-12。

最后这个重组的菌株经过补料分批培养的L-苏氨酸产量高达51.1g/L.每克蔗糖可以产0.284gL-苏氨酸。

张力[3]等人根据大肠杆菌L-苏氨酸生物合成途径及其调节机制和赖氨酸生物合成途。

可知，dapA基因是L-赖氨酸生物合成途径中的关键酶一一二氢吡啶二羧酸合成酶的编码基因．通过敲除dapA基因可以切断L-天冬氨酸向赖氨酸的合成支路，解除过量赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制，增强L-苏氨酸合成途径中碳源的代谢流。

在相同培养条件下发酵48 h，重组菌株K12AdapA发酵液中积累的L-苏氨酸达3.71 g/L，是大肠杆菌K12原始菌株的3倍。

Kim, YH[4]等人通过将野生型的大肠杆菌菌株和突变后的高产菌株对比，发现参与L-苏氨酸生物合成的12种代谢相关的酶有明显的不同。

在突变株中苹果酸脱氢酶提高了30倍多，而柠檬酸合成酶的合成则严重受到抑制，这样就可以抑制将草酰乙酸转化成柠檬酸，提高苹果酸氧化层草酰乙酸。

草酰乙酸是苏氨酸合成的关键前体。

同时，在突变株中，天冬氨酸激酶的合成也被抑制了，这样可以避免其将天冬氨酸降解成其他物质如延胡索酸等，同样的，苏氨酸脱氢酶的表达也需要严格的控制。

还发现，较低量的胱硫醚-β-裂解酶可以导致高丝氨酸的积累。

L-苏氨酸发酵工艺的调控
1、培养基的优化
工业上L-苏氨酸的生产成本主要是在于培养基。

其中，碳源和氮源是主要花费。

Man-Hyo Lee[5]等人采用大肠杆菌突变株MT201，该菌株对苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊具有抗性并且是L-甲硫氨酸缺陷性的菌株，在低盐浓度培养基对L-苏氨酸的生产实现优化。

他们发现若在培养基中加入生物素，则其可作为生长因子使L-苏氨酸的产量提高到52.0 g/l。

并且对其进行连续添加还有浓度为5g/l的L-甲硫氨酸补料培养基同样可以提高L-苏氨酸的产量。

高菌浓会使培养基中的氧气有限，这样就会导致一些有机酸的积累。

为了克服该问题，所以同样需要往反应器中提高富含氧气的空气，最后使得在低盐浓度培养基中的L-苏氨酸的产量高达80.2 g/l。

Ning Chen[6]等人认为在L-苏氨酸生产中，蔗糖是最优的初始碳源，因为葡萄糖能被大肠杆菌快速吸收用于糖酵解和TCA循环导致乙酸积累，抑制了细胞的生长，相应的L-苏氨酸量减少，但若使用蔗糖为初始碳源，则需要将蔗糖逐渐水解成葡萄糖和果糖，对糖酵解具有一定的耐受性。

通过采用大肠杆菌TRFC在5L发酵罐中进行一系列的补料分批培养之后确定蔗糖的最优浓度是70 g/L。

当初始蔗糖耗尽之时，认为采用葡萄糖进行补料最为合适。

Zhu[7]等人报道高浓度的葡萄糖会影响到培养早期的菌体的生长，减少其浓度可以缩短延迟期。

类似的，葡萄糖补料需要在一个较低的浓度。

通过采用不同浓度的葡萄糖补料。

发现将发酵液中残糖浓度控制在5到20 g/L可以增加L-苏氨酸的产量和生产力，通常控制在10g/L。

Ning Chen[6]等人还发现具有DO-控制脉冲补料分批培养中的L-苏氨酸的产量和生产力最大。

其中脉冲周期可以从30s到90s。

之前有报道称硫酸铵和酵母提取液是最佳的无机和有机氮源。

C/N比对于细胞密度和产物浓度比氮源浓度的作用更为重要。

C/N直接影响菌体的生长和代谢，如果C/N偏小，会导致菌体生长过剩，易造成菌体提前衰老自溶；C/N过大，菌体繁殖数量少，发酵密度低，细菌代谢不平衡，不利于产物的积累[8]。

发现在5L发酵罐中，最佳的蔗糖/硫酸铵比为30，最后所得的L-苏氨酸产量为118 g/L，细胞重量为27.4 g/L。

生产力为3.10 g/L/h。

2、副产物对于L-苏氨酸生产的影响
乙酸、乳酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸为L-苏氨酸发酵的主要副产物。

其中乙酸一般2种情况下产生，设备的供氧能力不足使工程菌的呼吸受到限制或葡萄糖的摄入速率大于工程菌TCA循环的周转能力。

冯志彬[9]等人发现当乙酸积累会抑制L-苏氨酸的生产，不能超过2g/L。

缬氨酸与乳酸一样，主要是由于溶氧不足产生的，当溶氧提高，则缬氨酸浓度则不会再增加，乳酸可以被菌体重新利用。

并且相对于乙酸，在有氧情况下，乳酸对L-苏
氨酸的生产菌影响不大，但当其浓度高于10g/L的时候，则会抑制苏氨酸的合成。

同时L-苏氨酸的生产菌的最适PH为7.0，该PH值虽然适于菌体生长，但对氧需求较高，由于设备的限制，往往这时候的溶氧会偏低，代谢发生异常，基质中的碳代谢流流向对氧需求较低的代谢支路，如乙酸、乳酸和缬氨酸的生成量较高，而乙酸、乳酸的过量积累会抑制菌体苏氨酸合成酶系的活力，造成产酸水平不高。

在pH6.5的培养情况下生物量虽然略低但副产物生成较少，L-苏氨酸产量反而偏高。

这说明在溶氧受限的情况下调低pH有利于L-苏氨酸发酵的正常进行。

陈宁[10]等人发现，葡萄糖酸是戊糖磷酸途径中间产物，作为前体物葡萄糖酸生成核酮-5-磷酸、核糖等戊糖、四糖；且使得葡萄糖进一步通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶积累代谢副产物，造成苏氨酸产量下降。

3、溶氧对于L-苏氨酸生产的影响
徐庆阳[11]溶氧，可有效地提高苏氨酸的产量和糖酸转化率。

如图1，HMP途径作为提供NADPH的主要途径，增大HMP途径的代谢流是维持和提高天冬氨酸族氨基酸生物合成
所必需的。

随着溶氧的增加，则通往HMP途径的流量将增加，而合成6-磷酸果糖途径的流量则减少。

大肠杆菌中CO2固定反应是提供苏氨酸前体物草酰乙酸的主要途径，一部分PEP 在PPC的作用下可以合成草酰乙酸，另一部分PEP则会进入TCA循环或者合成一些副产物。

在TCA循环中合成的α-酮戊二酸有一部分会在在谷氨酸脱氢酶催化下形成谷氨酸，生产的谷氨酸可以通过转氨基作用合成天冬氨酸，从而合成苏氨酸，另一部分则继续TCA循环。

所以需要削弱TCA循环，以溶氧浓度为5%和20%为例，溶氧浓度为20%的情况下，进入TCA的碳架明显小于5%，相对的进入HMP途径、草酰乙酸途径和谷氨酸途径的流量明显增加，合成的苏氨酸量自然增加。

有报道表明，通过发酵条件的强制振荡可以有效平衡微生物菌体内部代谢和生长的不同生理需求，从而克服传统发酵的一些缺点。

由于在溶氧振荡过程中，葡萄糖可能会严重下降，从而抑制微生物细胞生物量的合成和L-苏氨酸的生物合成，因此，适当的溶氧强制振荡配以合适的葡萄糖流加将是一个有效控制副产物产生的措施。

黄金[11 ]等人采用溶氧强制振荡工艺能够明显提高苏氨酸的发酵产率和降低多种抑制性产物的合成。

经过36h培养．细胞生物量达到29.5 g.L-1，苏氨酸的质量浓度达到118.9 g.L-1，而乙酸质量浓度下降到0.8 g/L，副产的其他氨基酸也大大降低。

HMP途径的代谢流量提高至95.88，C02固定反应代谢流量提高至86.1，TCA循环相对代谢流量提高至17.78，从而导致苏氨酸对葡萄糖的质量转化率增加至57％。

参考文献
[1] Lee K wang Ho, Park Jin Hwan, Kim Tae Yong. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production. MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY, 2007, 3.
[2] Jeong Wook Lee, Sol Choi.Jin Hwan Park, Claudia E. Vickers, Lars K. Nielsen, Sang Yup Lee. Development of sucrose-utilizing Escherichia coli K-12 strain by cloning β-fructofuranosidases and its application for L-threonine production. APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY. 2010.88:905–913.
[3] 张力，李伟星，杨晓志，张君胜. dapA基因缺失对大肠杆菌L一苏氨酸产量的影响. 甘肃农业大学学报. 2011,(4) 151-156.
[4] Kim, YH, Park, JS, Cho, JY, Cho, KM, Park, YH, Lee, J. Proteomic response analysis of a threonine-overproducing mutant of Escherichia coli. 2004,381: 823-829
[5] Man-Hyo Lee, Hong-Weon Lee, Jin-Ho Park, ,Jung-Oh Ahn, Joon-Ki Jung, Yong-Il Hwang. Improved L-Threonine Production of Escherichia coli Mutant by Optimization of Culture Conditions. JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING. 2006,101(2):127-130. [6] Ning Chen, Jin Huang, Zhi-bin Feng , Lei Yu, Qing-yang Xu, Ting-yi Wen. Optimization of Fermentation Conditions for the Biosynthesis of L-Threonine by Escherichia coli. Appl Biochem Biotechnol. 2009,158:595–604.
[7] Zhu M., Yu L.-J., Li W., Zhou P.-P., Li, C.-Y. . Enzyme and Microbial Technology.2006, 38, 735–740.
[8] 钱运镛．发酵工程最优化控制．江苏：科学技术出版社，1998
[9] 冯志彬，徐庆阳，陈宁. 代谢副产物对L-苏氨酸发酵的影响及应对措施.食品与发酵工业.2007,33(6):32-35
[10] 陈宁，朱晓光，徐庆阳，黄金. 基于途径分析的一苏氨酸发酵过程优化. 天津科技大学学报. 2008,23(3):1-4.
[11] 黄金，谢希贤，徐庆阳，温廷益,陈宁. 溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其代谢流迁移的影响. 高校化学工程学报.2010,24(1):93-98。