发酵工程培养基

❖ 含丰富的糖、氮、无机盐、维生素等。主要 含蔗糖，总糖可达50一75%。
❖ 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜的成分有所不同。
❖ 甘蔗糖蜜是以甘蔗为原料，经过压榨，其蔗 汁在经过澄清、净化、过滤处理后，蒸发浓 缩、结晶及助晶、离心分离出来的褐色浓稠 的液体，其中含有较大量的蔗糖和转化糖。
❖ 糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生产中，抗生 素等微生物工业也常用它作碳源。
发酵工程的流程
空气 空气净化处理
保藏菌种 斜面活化 扩大培养
原料预处理 培养基制备灭菌
种子罐 发酵罐
灭菌
产物分离纯化
成品
第一节 培养基的成分及来源
一、碳源营养
❖ 常用碳源：糖类、油脂、有机酸和低碳醇。
❖ 各种菌种对不同碳源的利用速率和效率不一 样。
1.葡萄糖
❖ 微生物最易利用，是加速生长的有效的糖。
第三章 发酵工业培养基 及原料处理
❖ 发酵工业培养基是工业发酵微生物生长和分 泌发酵产物的营养物质。
❖ 发酵培养基营养基质一般含五大方面要素： 碳源、氮源、无机盐及微量元素、水，以及 生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂等。
❖ 淀粉质原料是发酵工业的重要原料，必须水 解成葡萄糖等可发酵性糖，才能被生产菌利 用；糖蜜原料也需要进行处理，发酵才能顺 利进行。
❖ 用物理或者化学方法进行改良处理，以控制 水的硬度和离子浓度等影响发酵的重要指标。
五、生长因子、前体、促进剂和抑制剂
1.生长因子 ❖ 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微
量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维 生素等均称生长因子。 ❖ 狭义的生长因子一般仅指维生素。 ❖ 生长因子是微生物自身不能合成而且是生长 必不可少的营养物。
❖ 钾：
❖ 与细胞渗透压和透性有关，是许多酶的激活 剂，能促进糖代谢。
❖ 在谷氨酸发酵中，菌体生长时需要钾离子约 0.01%，生产谷氨酸时需要约为0.020.1%(以硫酸钾计)。
四、水
❖ 不同水源中存在的各种因素，对微生物发酵 代谢影响甚大。
❖ 影响水源质量的主要参数：pH值、溶解氧、 可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含 量。
❖ 但也有一些产物要求磷酸盐浓度高些。 ❖ 例如：淀粉酶，添加超过菌体生长所需要的
磷酸盐浓度，则能显著增加产量。
❖ 钙：
❖ 能控制细胞透性。
❖ 常用碳酸钙，能与代谢产生的酸起反应，对 pH有一定的调节作用。
❖ 配制培养基时，要先将培养基用碱调到中性， 才能将碳酸钙加入。
❖ 培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀， 降低了培养基中可溶性磷的含量。因此，当 培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将二 者分别消毒或逐渐补加。
3.淀粉、糊精
❖ 淀粉在发酵工业中被普通使用，它可克服葡 萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富， 价格也比较低廉。
❖ 常用：玉米淀粉，小麦淀粉和甘薯淀粉等。
❖ 有些微生物可直接利用玉米粉、土豆粉作碳 源。
❖ 纤维素和含淀粉较多的野生植物也是今后开 发碳源的广阔天地。
4.油和脂肪
❖ 脂肪作碳源时需供给比糖代谢更多的氧，否 则，大量脂肪酸和代谢中的有机酸积累，pH 下降，影响酶作用。
❖ 磷：
❖ 具有重要代谢调节作用，有利于糖代谢，能 促进微生物的生长，但磷若过多时，许多产 物的合成受抑制。
❖ 例1：在谷氨酸的合成中，磷浓度过高就会抑 制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，使菌体生长 旺盛，而谷氨酸的产量却很低，代谢向缬氨 酸方向转化。
❖ 例2：链霉素、土霉素、新生霉素、柠檬酸等 都受到磷浓度的影响。许多次级代谢过程对 磷酸盐的承受限度比生长繁殖过程低，必须 严格控制。
❖ 控制生物素的加入量，可以促进谷氨酸从细胞内分 泌到细胞外。
❖ 加聚乙烯醇衍生物可防止菌丝结球，提高糖化酶的 产量。
4.抑制剂
❖ 抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径 活跃，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代 谢的某一代谢中间物积累起来。
❖ 举例：
❖ 微生物发酵生产甘油。在发酵液中加入亚硫酸氢钠， 它与代谢中产生的乙醛生成加成物，使乙醇的产生 受阻
❖ 微生物所需的维生素多为B族维生素，如 VB1（硫胺素）、VB2（核黄素）、VB3 （泛酸）等。
❖ 有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数 有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素 及一些微生物生长不可缺少的生长因子。如 玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液等。
❖ 如谷氨酸发酵使用生物素缺陷型菌株，以生 物素为生长因子，正常情况细胞内不积累谷 氨酸，生物素不足可改变细胞膜透性，胞内 谷氨酸渗出，发酵液中累积谷氨酸。
❖ 不同微生物及不同的生长阶段对这些物质的 最适浓度要求均不相同。
❖ 镁、磷、钾、硫、钙和氯等常以盐的形式加 入。例如：硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二钾、 碳酸钙、氯化钾等。
❖ 钴、铜、铁、锰、锌、铜等微量元素，除了 合成培养基外，一般不再另外单独加入。
❖ 但有些发酵上业中也有单独加入微量元素。 例如：生产维生素B12，因钴是组成成分， 因此需要加入氯化钴。
❖ 又如肠膜状明串珠菌的生长需要补充10种维 生素、19种氨基酸、3种嘌呤及嘧啶等。
2.前体
❖ 能直接结合到产物中，而自身结构没有多大 变化，但是产物产量却有较大提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
❖ 如青霉素生产中，加入玉米浆，产量增加， 原因是玉米浆含有苯乙酸，被优先结合到青 霉素分子中去。
❖ 尿素：
❖ 常用有机氮源，但它成分单一，不具有上述 有机氮源的特点。
❖ 在青霉素、谷氨酸等生产中也常被采用。尤 其是在谷氨酸生产中，尿素可提高谷氨酸的 生产。
❖ 有机氮源有的还是产物的前体。
三、 无机盐及微量元素
❖ 作为生物活性物质的组成或生理活性作用的 调节物。
❖ 低浓度时对生长和产物合成有促进作用，高 浓度时常表现出明显的抑制作用。
2*1，3-二磷酸-甘油酸 2*ADP
2*乙醛（氢受体） （CH3CHO）
2*3-P-甘油酸
2*ATP
CO2
2*丙酮酸
2*ATP
2*2-P-甘油酸
2*磷酸烯醇式丙酮酸 2*ADP
NADH在细胞中积累，激活３ -磷酸甘油脱 氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮作为NADH 的 受氢体，而还原为 ３ - 磷酸甘油酸，再由甘油激 酶催化形成甘油。
❖ 镁： ❖ 除叶绿素，不参与细胞的组成。 ❖ 酶激活剂，影响基质氧化与蛋白质合成。
❖ 常以硫酸镁加入，碱性溶液中会生成氢氧化镁沉淀， 配料时要注意。
❖ 硫： ❖ 是含硫氨基酸的成分和某些辅酶的活性基，如辅酶
A、硫辛酸和谷胱甘肽等。 ❖ 在某些产物中硫是组成元素。在其生产培养基中，
需要加入硫酸钠或硫代硫酸钠等含硫化合物作硫源。
酶制剂的发酵。
7.甲醇、乙醇 ❖ 已作为生产SCP的碳源。 ❖ 近年来国外用乙醇代粮发酵的工艺发展也十
分迅速，菌体得率比葡萄糖等还高。
二、氮源营养
❖ 有机氮源和无机氮源应当混合使用。
❖ 早期：容易利用易同化的氮源——无机氮源。 ❖ 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白
质。
1.无机氮 ❖ 常用的有：铵盐、硝酸盐和氨水等。也称为
❖ 常用的油：豆油、菜油、葵花子油、猪油、 鱼油、棉子油等。
5.有机酸
❖ 乳酸、柠檬酸、乙酸等有机酸或它的盐也能 作碳源。
❖ 有机酸的利用常会使pH上升，尤其是有机酸 盐氧化时，常伴随着碱性物质的产生。
❖ 不同碳源在氧化时，对pH的影响各不相同。
6.正烷烃 ❖ 己用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和
CH3CHO+NaHSO3 → CH3CHOH - OSO3Na ❖ 乙醛不能成受氢体，而使NADH在细胞中积累。
G ATP ADP
6-P-G
6-P-F ATP ADP
1，6-二磷酸-果糖
EMP途径 乙醇发酵
2*3-磷酸-甘油醛
Pi
2*NAD+ 2*乙醇（CH3CH2OH）
2*NADH+H+
乙醇脱氢酶
❖ 另外在氨水中还含有多种嗜碱性微生物，因 此在使用前应用石棉等过滤介质进行除菌过 滤。
2.有机氮源
❖ 常用：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉 米浆、玉米蛋白粉、蛋白陈、酵母粉、鱼粉、 蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。
❖ 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成 氨基酸，被吸收后再进一步分解代谢。
❖ 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还 提供大量的无机盐及生长因子。
2）天然培养基
❖ 采用天然原料，化学成分不清楚或不恒定， 如动植物组织或微生物浸出物、水解液等。
速效氮源。
❖ 无机氮源的迅速利用会引起pH的变化。 ❖ 生理酸性物质：硫酸铵。 ❖ 生理碱性物质：硝酸钠。
❖ 正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发 酵过程的pH有积极作用。
❖ 氨水：
❖ 在发酵中除可以调节pH外，它也是一种容易 被利用的氮源，在许多抗生素的生产中得到 普遍使用。
❖ 氨水因碱性较强，因此使用时要防止局部过 碱，加强搅拌，并少量多次地加入。
❖ 酒精生产中若用糖蜜代甘薯粉，可省去蒸煮、 制曲、糖化等过程，简化了工艺。
❖ 糖蜜使用的注意点：
❖ 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的， 但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预 处理。
❖ 例：谷氨酸发酵
❖ 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结 晶）、生物素（发酵控制）。
❖ 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 ❖ 例：柠檬酸发酵 ❖ 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）。 ❖ 预处理：→黄血盐
亚硫酸氢纳是乙醇代谢的抑制剂，促使甘油 形成。
亚硫酸钠也是乙醇代谢的抑制剂
溴化剂能抑制金霉素形成的代谢途径，促使 四环素的生成。
第二节 培养基的类型及选择
一、培养基的类型 1.按纯度 1）合成培养基 ❖ 各种成分明确、稳定的化学试剂配制。 ห้องสมุดไป่ตู้ 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化 规律。 ❖ 培养基营养单一，价格较高，不适合用于大 规模工业生产。
❖ 铁：
❖ 是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶 的成分，是菌体有氧氧化必不可少的元素。
❖ 铁制发酵罐内的溶液即使不加任何含铁化合 物，其铁离子浓度已达30 μg/ml。
❖ 一些天然培养基的原料中也含有铁，所以在 一般发酵培养基中不再加入含铁化合物。
❖ 有些产品对铁很敏感：
❖ 例1：青霉素要求最适铁含量在20μg/ml以下。
❖ 但过多的初始葡萄糖会抑制微生物生长，引 起葡萄糖效应，这主要是葡萄糖的分解代谢 阻遏造成。
❖ 另外过多葡萄糖会过分加速菌体呼吸，以致 溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物积 累，pH下降，影响微生物生长和产物合成。
2.糖蜜 ❖ 又称糖浆，俗称糖稀。
❖ 生物发酵工业所用的糖蜜，主要是指制糖工 业上的废糖蜜，它是甘蔗糖厂或甜菜糖厂的 一种副产品。
❖ 有些前体浓度过高时对菌体有毒性。此外， 菌体还能分解前体，且前体相对价格较高， 添加过多，容易引起挥发和氧化，因此常采 用少量多次地加入。
3.促进剂
❖ 指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量 的添加剂。
❖ 举例：
❖ 加巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌 推迟自溶，延长分泌期。
❖ 加酵母甘露聚糖可诱导甘露糖苷酶的产生，促使甘 露糖链霉素转化为链霉素。
❖ 例玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物 素）、苯乙酸、较多的乳酸，硫、磷、微量 元素等；磷酸肌醇。
❖ 玉米浆：
❖ 易被利用的氮源，对促进红霉素、链霉素、 青霉素和土霉素的生产有作用。
❖ 是玉米淀粉的副产物，固形物含量50%左右， 还含有较多的有机酸，如乳酸，pH在4左右。
❖ 玉米来源不同，加工条件不同，玉米浆的成 分常有较大波动，在应用时应注意适当调配。
❖ 氯：
❖ 一般不具营养作用，但嗜盐菌除外。
❖ 在含氯产物发酵中，除从原料和水中带入的 氯外，还需加入约0.1%氯化钾以补充氯离子。
❖ 啤酒糖化时，氯离子在20-60 mg/l内，能赋 于啤酒口味柔和，并对酶和酵母的活性有促 进作用。但氯含量过高会引起酵母早衰，使 啤酒带有咸味。
❖ 钠：
❖ 与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加 入少量钠盐，但用量不能过；否则会影响生 长。
❖ 例2：柠檬酸生产中，铁离子会激活顺乌头酸 酶，使柠檬酸进一步代谢为异柠檬酸，据报 导在无铁培养基中产酸率可比含铁培养基提 高近3倍。
❖ 例3：生产啤酒时，糖化用水若铁离子浓度高， 就会降低酵母发酵活力。
❖ 铁：
❖ 新发酵罐往往会造成培养基铁离子浓度过高， 所以要加以处理。
❖ 处理方法：罐内壁涂生漆或耐热环氧树脂， 以防止铁离子脱落。