多酚氧化酶的制备和性质研究

多酚氧化酶的制备与性质研究

10级生物工程（2）第二组1002012025姜文能 1002012022鲍仕伟 1002012011杜敏 1002012002张强 1002012039肖辉

摘要：多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。

关键字：多酚氧化酶系统、提取、性质研究

多酚氧化酶的简介

多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红茶加工过程中的

发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。

多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

活性测定

常用检压法和分光光度法。前者应用多酚氧化酶(PPO)可催化儿茶素等底物在有氧条件下的氧化还原反应，根据底物的氧化速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比这一原理，用瓦氏呼吸仪测定反应过程中的耗氧量求得PPO活性的大小，此方法设备简便，但操作复杂，误差较大。后者利用邻苯二酚和D-儿茶素在PPO催化下生成有色产物.其显色物质在460纳米处有最大吸收，吸收值在单位时间内的变化和单位酶活性成正比，计算PPO活性强度。操作方法简便，重现性好。与检压法原理相似的方法有氧电极法，应用也较多。

苹果中多酚氧化酶了解：（苹果、多酚氧化酶、褐变、抑制剂）苹果的果皮、果芯中均含有较多的多酚物质,在苹果榨汁过程中,大部分多酚物质随果皮和果芯而转移到果渣中,因此苹果渣中含有较多的多酚物质。苹果中的多酚氧化酶是引起苹果及苹果酒褐变的重要

原因之一，用乳化剂及酚结合剂从苹果中提取多酚氧化酶（PPO），研究其酶学性质：不同底物的Km、Vm，反应的最适温度、pH及两种底物同时存在时的酶学效应.结果表明：4-甲基儿茶酚为最适底物，其最适温度30 ℃，最适pH 4.5，不同浓度咖啡酸对酶的影响不同，儿茶素对不同浓度绿原酸的酶促反应影响也不同.研究几种效应物对酶活力的影响表明：偏重亚硫酸钠、半胱氨酸、抗坏血酸为强烈抑制剂，羧酸类对酶具有抑制效应，肉桂酸比同一结构形式的苯甲酸抑制效果强.

苹果中多酚氧化酶的提取：

1、材料选用优质苹果

2、仪器分光光度计、家庭用果汁捣碎机、台式高速离心机

3、方法

多酚氧化酶（PPO）的提取

①苹果洗净后在4℃保温，再去皮后取果肉200.0克，立即加人冷冻丙酮500ml，用高速组织捣碎机匀浆2min；用纱布过滤，滤饼用200ml 冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末冷冻真空干燥，即得PPo丙酮粉。

②称取丙酮粉O．5g，溶于250m1 0.05mol／L．pH的预冷(4℃)磷酸盐缓冲溶液，用磁力搅拌器搅拌20min，5000r／min离心10min，上清液过滤，即得PP0粗酶液。

苹果中多酚氧化酶性质研究：（含量、温度对含量的影响研究）

含量：

试剂：0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液

0.1mol/L邻苯二酚

仪器：分光光度计

含量测定：在1 m1磷酸盐缓冲液中，用lml 0.1mol/L的邻苯二酚为底物，加1ml酶提取液，反应3min后，在分光光度仪上扫描并观察300-450nm波长范围内的吸收峰情况。测定时以蒸馏水为空白对照，以热失活的粗酶提取液代替酶提取液在同样条件下测定为对照。

温度影响：

多酚氧化酶对热敏感，其最适温度为25 ℃，处理1min酶基本钝化。苹果多酚氧化酶的催化氧化邻苯二酚的产物，在400nm处有一最大吸收峰。测定产物在1min内400nm处吸光值的变化反映多酚氧化酶的活性。

不同温度对PP0活性的影响:

绘制标准曲线：以400nm为纵坐标，温度为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

曲线样图：

参考文献：《多酚氧化酶》，百度网

结论：多酚氧化酶的活性受温度的影响，在25℃之前酶的活性随温度的上升而渐渐增加，25℃是酶的最适温度，之后酶的活性随温度的升高渐渐下降，大约在30℃附近多酚氧化酶失活。