实验十二 产蛋白酶菌株的筛选
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不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形 成蛋白水解圈,细菌在平板上的生长条 件和液体环境中生长的情况相差很大, 因此在平板上产圈能力强的菌株不一定 就是碱性蛋白酶的高产菌株。
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碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国 颁布标准QB747-80进行。
原理:Folin试剂与酚类化合物 (Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应 形成蓝色化合物,用蛋白酶分解酪蛋白 生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色 反应,通过分光光度计测定可知酶活大 小。
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5 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋 白酶活力
用初筛获得的5株蛋白酶菌株接种到发酵 培养基中,37 ℃、200r/min 摇床培养 48h。
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6 酶活力的测定
空白对照 发酵液(或其稀释液)1ml
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 2% 酪蛋白1 ml
样品 发酵液(或其稀释液)1ml
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一 实验器材
1 菌株
从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株
2 溶液和试剂
蛋白胨,酵母粉,脱脂奶粉,琼脂,干酪素, 三氯醋酸,NaOH,Na2CO3,Folin试剂, 硼砂,酪氨酸,水等
3 仪器和用品
三角烧瓶,培养皿,吸管,试管,涂布棒, 玻璃搅拌棒,水浴锅,分光光度计,培养 摇床,高压灭菌锅,尺,玻璃小漏斗和滤 纸
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(3)PH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂 19.08克溶于1000ml水中;NaOH4g, 溶于1000ml水中,二液等量混合。
(4)2%酪蛋白:称取2g干酪素,用少量 0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11 的硼砂- NaOH缓冲液,加热溶解,定 容至100ml,4℃冰箱中保存,使用期不 超过一周。
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2 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液, 取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混 合,40 ℃水浴显色30min,680nm测 定吸收值并绘制标准曲线,求出观密度 为1是相当的酪氨酸质量( μg ),及K 值。
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3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株 取少量土样混于无菌水中,梯度稀释后涂 布到牛奶平板上,37 ℃培养30h左右观 察
建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
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4 产蛋白酶菌株的观察与转接
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数 进行记录,选择蛋白水解圈最大的5个菌 株进行测量和记录菌落和透明圈得直径, 然后转接到肉汤琼脂斜面上,37 ℃培养 过夜。
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二 实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白 酶产生菌的方法
学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法
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三 基本原理
自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平 板上生长后,其菌落周围可形成明显的 蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值常被作为判断 该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
U=K×A×N×5/10 K:由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪 氨酸质量,本实验K=200 N:稀释倍数 A:样品OD值与空白对照OD值之差 5/10:测定中吸取的滤液是全部滤液的 1/5,而酶反应时间为10min
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实验报告
1结果记录 2思考题
(1)在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌 的比例如何?试结合采样地点进行分析。
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四 操作步骤
1ห้องสมุดไป่ตู้培养基和试剂的配制
(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体 培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶
(2)发酵培养基:玉米粉4%,黄豆饼粉 3%,Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到 9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧 瓶的装瓶量为50ml。
(2)在选择平板上形成蛋白透明水解圈大 小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力 的直接证据?试结合你初筛和复筛的结果 分析。
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2% 酪蛋白1 ml 40℃水浴保温10min
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml
静置15min,使蛋白质完全沉淀,然后用滤纸过滤,滤纸应清亮,无絮状物
滤液1ml
0.4mol/l Na2CO3,5ml Folin试剂1ml
40℃水浴保温20min ,于680nm处测定OD值
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碱性蛋白酶活力单位U,以每毫升样品在40 ℃,pH11条件下,每分钟水解酪蛋白所产 生的酪氨酸质量()来表示。
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
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碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性 的蛋白酶,在轻工、食品、医药工业中 用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白 酶都是胞外酶,具有产酶量高,适合大 规模工业生产等优点,被认为是最重要 的一类营业性酶类。
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从自然界筛选获取有用的微生物资源一 直是微生物学的一项重要工作,也是学 习微生物学的学生应该掌握的基本技能。