植物生物反应器共33页文档

外显子1为193bp的核苷酸片断 ，外显子2为104bp的核苷酸 片断，外显子3为192bp的核苷酸片断 ，总长为500 bp左右。 经凝胶电泳后，与预期的大小一致。
获得序列的测序结果
BamH I Xbal I
EcoR I
GGATCCTCTAGAGATTGAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCCG
TAGAGGATCC
Xbal I BamH I
测序得到的序列提交genbank比对，核苷酸的同源性达96.0％。 将翻译后的蛋白序列提交genbank比对，蛋白质同源性达98.8％。
核苷酸比对结果：
蛋白比对结果：
将所获得的KGF核苷酸编码序列与Genbank中已有的KGF核苷酸序列比对，核苷酸序 列同源性达96.0%（其中外显子1为100%同源，差异都位于外显子2和外显子3中）。由于 外显子1根据genbank序列设计，因而外显子1与genbank上的数据100%同源,同时这也说 明了在本实验延伸PCR的过程并不存在碱基的突变，或碱基突变的频率比较低。而外显 子2、外显子3与genbank的差异推测为人种间的差异。氨基酸序列比对，同源性达98.8%。 成熟肽的第122-132个氨基酸之间是KGF的受体特异性结合位点，在此位点无氨基酸位点 突变。蛋白比对结果显示第36、40、43位点存在差异，但研究发现成熟肽的前19个氨基 酸丢失并不会影响成熟肽的活性，因此这些位点的差异不会影响蛋白的活性、功能。
图1、外显子1核苷酸获得图示
KGF全长的获得图 图2 KGF序列获得图示
KGF三段外显子及全长的凝胶电泳图
图3、PCR产物凝胶电泳图 M DNA marker DL2 000 1 外显子1, 2 外显子2, 3 外显子3 4 阴性对照
图4、KGF核苷酸凝胶电泳图 M 、DNA marker DL2000, 1 、KGF片段
要的作用。 2、动物的精囊发生 。 损伤修复功能及减少化疗的损伤 1、皮肤损伤修复， 2、肠胃损伤的修复， 3、减少放化疗的伤害。
以胡萝卜、水稻为植物反应器表达KGF的意义
首先，具有植物反应器的优点 胡萝卜 （1）营养丰富
（2）营养保健品 食用含KGF的胡萝卜可以辅助治疗肠胃疾病，药敷则
可加快皮肤伤口的愈合。因此在胡萝卜中表达高活性的 KGF将具有重要的商业价值 。
TTTTTTGTTCTTTCTTCGTTTTCTTCCCTTTGACAGGAAGCCCCTTTTGATT
TAAGGCCACGAACATTTCCCCTCCGCTGTGTGTCCATTTAGCTGATGCATAG
GTGTTGTAATGGTTTTCCAGAATCAGTTCTTTGAAGTTGCAATCTTCATTGC
TATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTCTCACTCTTAT
Leabharlann Baidu
ATCCCCTCCTTCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAA
CAGTTCACATTTGTAGCCATTTGCTCTGGAGTCATGTCATTGCAAGCCATTC
水稻
(1)美容保健品
(2)“米疗” 在水稻中表达人KGF，这无疑给水稻这位美容新秀更
添一“亮点”，即使用萃取的水稻精华及水稻中表达的 人KGF可以在对皮肤进行保养的同时加快伤口、疤痕的 修复，角质细胞更新。
角质细胞生长因子的核苷 酸序列的获得
技术流程
植物水稻、胡萝卜表 达体系的建立
植物表达载体的构建
（2）KGF基因编码一有194 个氨基酸的蛋白质。基因含 有三个外显子和两个内含子。
（3）KGF是由间充质来源的细胞产生的，通过旁分泌途 径特异地作用于上皮细胞。
（4）KGF具有很强的促上皮细胞分裂的功能。
角质细胞生长因子的生物学功能
KGF在生长发育中器官的分化、形成中起重要作用 1、肺表皮细胞的生长、分化和成型及肺的分支形成中起着重
外显子3：4号引物5’-CTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAA-3’ 3’(3)引物 5’-GAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3’
用人肺组织块提取的DNA为模板，PCR获得相应的外显子序列。
外显子1的获得
1号引物 5’-GATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCA-3’ Ⅰ 5’-GGCGGATCCTCTAGAATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAA-3’ Ⅱ 5’- TCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGC-3’ Ⅲ 5’- ATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGG-3’ Ⅳ 5’- GGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAG-3’ Ⅴ 5’-CAAAGTAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGAC-3’
农杆菌介导的转化 共培养，筛选出抗性愈伤
筛选培养基上抗性苗的获得
检测
GUS检测
PCR检测 Southern botting RT-PCR检
测
Western botting
角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得
重叠延伸PCR方法获得角质细胞生长因子编码序列 1）重叠延伸PCR介绍
2）外显子2、3的获得
外显子2：2号引物： 5’-GAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCA-3’ 3号引物： 5’-TGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTT-3’
1 植物反应器概述
植物生物反应器定义 优点： （1）蛋白翻译后正确修饰、加工， （2）生产成本低， （3）生产工艺简单， （4）存储、使用简单方便， （5）使用安全。
角质细胞生长因子概述
（1）角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)是1989 年由Rubin 等首先从人胚胎肺成纤 维细胞的生长培养液中分离出来的。是成纤维细胞生长 因子家族的成员之一。
ATTCTTTCTTTGCATAGAGTTTCCCTTCTTTGTTCATGGCAAGATAGTATTC
ACTTTCCACCCCTTTGATTGCCACAATTCCAACTGCCACAGTCCTGATTTCC
ATGATATTGTAATTATTCTTCATCTCTTGGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTT