蛋白各组分含量测定方法
籽粒蛋白含量实验计划
一、实验材料：w6nk2，浙农8号成熟籽粒
二、分析测定指标：
成熟籽粒在80度烘箱中烘干至恒重，用样品粉碎机(DFT50高速中药粉碎机)粉碎，过0.5mm筛。依据Liu等(2005)提出的方法利用0.5g样品顺序提取蛋白质组分：清蛋白，0.5 g样品加10ml 10mM Tris-HCI(pH7.5)室温下置于连续振荡器上提取两次，每次2h，为提取残留物离心(4000g)10分钟，两次提取的上清液合并保存。依据同样步骤，球蛋白，加10ml 1M NaCl，Tris-HCI在室温下提取两次，每次2h；醇溶蛋白，加15ml 55％正丙醇(v/v)，Iris-HCl 室温下提取两次，每次2h；谷蛋白，残留物加25ml 0.24％五水合硫酸铜，1.68％KOH，0.5％酒石酸钾钠和50％(v/v)异丙醇提取显色液，室温震荡1.5h，再在60度恒温水浴震荡5 min，离心(4000 g)10min，550nm比色测定。
2、蛋白质总量、蛋白组分含量的测定
大麦籽粒蛋白质总量用近红外光谱分析仪(NIRA，Matrix.1，Bruker Co.，德国)测定，用本实验室早期建立的相关曲线计算(Yin等，2002)。
清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量利用考马斯亮蓝法以牛白蛋白做标准曲线测定(Bradford，1976)，谷蛋白用Biuret法测定(Holme和Peck，1998)。
或者蛋白质总量采用下面方法测定：
在装有50mg面粉放入 2 ml离心管中，加入150 µl提取液（10g KH2PO4，13g K2HPO4·3H2O，385mg DTT，加水至500ml），拧紧离心管盖子，室温下剧烈震荡1h。将匀浆1000g离心8min后，取上清用来测定蛋白质含量并跑电泳检测。
蛋白质含量用Bradford (1976)方法测定，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白。
蛋白各组分含量测定方法
籽粒蛋白含量实验计划 一、实验材料：w6nk2，浙农8号成熟籽粒 二、分析测定指标： 成熟籽粒在80度烘箱中烘干至恒重，用样品粉碎机(DFT50高速中药粉碎机)粉碎，过0.5mm筛。依据Liu等(2005)提出的方法利用0.5g样品顺序提取蛋白质组分：清蛋白，0.5 g样品加10ml 10mM Tris-HCI(pH7.5)室温下置于连续振荡器上提取两次，每次2h，为提取残留物离心(4000g)10分钟，两次提取的上清液合并保存。依据同样步骤，球蛋白，加10ml 1M NaCl，Tris-HCI在室温下提取两次，每次2h；醇溶蛋白，加15ml 55％正丙醇(v/v)，Iris-HCl 室温下提取两次，每次2h；谷蛋白，残留物加25ml 0.24％五水合硫酸铜，1.68％KOH，0.5％酒石酸钾钠和50％(v/v)异丙醇提取显色液，室温震荡1.5h，再在60度恒温水浴震荡5 min，离心(4000 g)10min，550nm比色测定。 2、蛋白质总量、蛋白组分含量的测定 大麦籽粒蛋白质总量用近红外光谱分析仪(NIRA，Matrix.1，Bruker Co.，德国)测定，用本实验室早期建立的相关曲线计算(Yin等，2002)。 清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量利用考马斯亮蓝法以牛白蛋白做标准曲线测定(Bradford，1976)，谷蛋白用Biuret法测定(Holme和Peck，1998)。 或者蛋白质总量采用下面方法测定： 在装有50mg面粉放入 2 ml离心管中，加入150 µl提取液（10g KH2PO4，13g K2HPO4·3H2O，385mg DTT，加水至500ml），拧紧离心管盖子，室温下剧烈震荡1h。将匀浆1000g离心8min后，取上清用来测定蛋白质含量并跑电泳检测。 蛋白质含量用Bradford (1976)方法测定，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白。
蛋白质的含量测定方法
蛋白质的含量测定方法 蛋白质是生物体内非常重要的一类有机物质，具有多种功能，包括酶催化、结构支持和信号传导等。因此，准确测定蛋白质的含量对于生物学、医学以及食品科学等领域的研究具有重要意义。 现在常用的蛋白质含量测定方法主要包括光谱法、生物物化学法和免疫学法。下面将分别介绍这几种方法。 1. 光谱法 光谱法是一种常用的定量测定方法，主要利用波长与物质浓度之间的关系来测定物质的含量。在蛋白质的测定中，最常用的是紫外吸收光谱法和红外吸收光谱法。 紫外吸收光谱法基于蛋白质中含有色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸的特性，可以通过测量在280纳米波长处的吸光度来间接估计蛋白质的含量。这种方法的优点是操作简单、快速且准确性高，但不适用于含有大量非氨基酸物质的样品。 红外吸收光谱法则可以直接测定蛋白质样本中氨基酸的特征吸收峰，从而估计其含量。这种方法需要使用红外光谱仪进行测定，操作稍微复杂一些，但适用范围广。 2. 生物物化学法 生物物化学法是利用蛋白质的化学性质与其他物质进行反应来测定蛋白质含量
的方法。最常用的是比色法和浊度法。 比色法是利用蛋白质与某些染料的反应来测定蛋白质的含量。最常用的是布拉德福德比色法和低里德尔比色法。布拉德福德比色法是使用染料布拉德福德蓝与蛋白质发生染色反应，然后通过测定染色溶液的吸光度来估计蛋白质的含量。低里德尔比色法则是使用染料洛斯隆巴尔尔棕与蛋白质发生比色反应，同样通过测定染色溶液的吸光度来测定蛋白质含量。 浊度法则是利用蛋白质与某些金属离子或染料等物质形成复合物，从而使溶液变得浑浊。通过测定浊度的变化来估计蛋白质的含量。这种方法简单、快速且灵敏度高，但对样品的纯度要求较高。 3. 免疫学法 免疫学法是利用蛋白质与特异性抗体之间的免疫反应来测定蛋白质含量的方法。最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）和西方印迹法。 ELISA是利用酶标记抗体与待测蛋白质结合后，通过测定酶的底物变化来进行定量测定的方法。ELISA具有高灵敏度和特异性，适用于复杂样品的测定，如血清中的蛋白质含量。 西方印迹法则是将待测蛋白质通过电泳分离，然后转移到膜上，再使用特异性抗体与其结合，最后通过酶标记抗体的反应来测定蛋白质的含量。西方印迹法适用
蛋白质含量测定方法
蛋白质含量的测定方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法。 1、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 2、双缩脲法 双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。 3、酚试剂法 取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。 4、紫外吸收法 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。 5、考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250定量结合。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm处的吸光度基
本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh2ch2cooh+3h2so42co2+3so2+4h2o+nh3（1） 2nh3+h2so4（nh4）2so4（2） （nh4）2so4+2naoh2h2o+na2so4+2nh3（3） 反应（1）、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经1800c左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o或0.9%nad酉己制，酪蛋白用0.05nnaoh配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4・5h2o）和6.0克酒石酸钾的knac4h4o6・4h2o）用500毫升水溶解在搅拌下加入300毫升10%naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 3见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入。,0.2,0.4,0.6,
4种蛋白组分的测定
4种蛋白组分的测定 蛋白质是生物体中不可或缺的基本营养物质，具有重要的生理功能。在科学研究和食品工业等领域，测定蛋白质的组分和含量是一项重要 任务。本文将介绍四种常见蛋白组分的测定方法，包括总蛋白、酪蛋白、胶原蛋白和麦芽蛋白。 一、总蛋白的测定 总蛋白是指生物体内所有蛋白质的总和，常用于评价生命的生物样 本中蛋白质的含量。常见的测定方法有比色法和光散射法。 1. 比色法：这是一种常见且简单的方法，基于蛋白质与某些化学试 剂发生颜色反应的原理。常用的比色试剂有布拉德福德试剂、伯松试 剂和Lowry试剂。通过与标准蛋白溶液进行比色反应，可以利用分光 光度计测定反应后溶液的吸光度，然后通过与标准曲线对比，确定样 品中总蛋白的含量。 2. 光散射法：这是一种通过测量蛋白质溶液中散射光的强度来测定 蛋白质浓度的方法。根据蛋白质的浓度和颗粒大小，散射光的强度也 会发生变化，利用散射光强度与蛋白质浓度的关系，可以计算出样品 中的总蛋白含量。 二、酪蛋白的测定
酪蛋白是奶制品中的主要蛋白质，具有良好的营养价值。常用的酪蛋白测定方法有比色法和酸碱滴定法。 1. 比色法：通过与酪蛋白反应的比色试剂，如联苯胺和二甲基氨基苯，形成有色化合物的方法来测定酪蛋白的含量。通过分光光度计测量比色反应后溶液的吸光度，并与标准曲线对比，确定样品中酪蛋白的含量。 2. 酸碱滴定法：这是一种基于蛋白质的氨基酸组成和等值点的性质来测定酪蛋白含量的方法。通过加入酸或碱溶液，使酪蛋白在等值点的pH值范围内发生电中性点，从而确定酪蛋白的含量。 三、胶原蛋白的测定 胶原蛋白是构成哺乳动物体内结缔组织的主要蛋白质，对于维持皮肤、骨骼和关节的功能至关重要。常用的胶原蛋白测定方法有氢氧化物溶解法和酶解法。 1. 氢氧化物溶解法：这是一种通过将胶原蛋白与氢氧化物溶液反应生成游离氨基酸的方法来测定胶原蛋白含量。通过检测胶原蛋白溶解反应后产生的游离氨基酸的含量，可以计算出胶原蛋白的含量。 2. 酶解法：这是一种通过将胶原蛋白与特定酶反应产生多肽链的方法来测定胶原蛋白的含量。通过测量酶反应后溶液中游离氨基酸或多肽链的浓度，可以得出胶原蛋白的含量。
蛋白含量检测方法
蛋白含量检测方法 蛋白质是构成细胞的重要组成部分，也是维持生命活动所必需的营养物质。因此，准确测定蛋白质含量对于生物学研究、食品质量控制和药物研发等领域具有重要意义。目前，有多种蛋白质含量检测方法可供选择，下面将介绍其中几种常用的方法。 1. 布拉德福法（Bradford assay）：这是一种常用的蛋白质测定方法，基于蛋白质与染料共价结合的原理。该方法使用吸光度测量，通过与标准蛋白质溶液进行比较，可以准确测定未知样品中的蛋白质含量。布拉德福法具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，适用于大多数溶液样品。 2. 低里氏法（Lowry assay）：这是另一种常用的蛋白质测定方法，基于蛋白质与铜离子和酸性荧光染料之间的反应。该方法具有较高的灵敏度，对于低浓度的蛋白质样品具有较好的测定效果。然而，低里氏法相对于布拉德福法来说操作稍复杂，需要较长的反应时间。 3. BCA法（bicinchoninic acid assay）：这是一种基于巴比特酸染料的蛋白质测定方法。BCA法与布拉德福法类似，都是通过蛋白质与染料反应形成复合物，并通过吸光度测量来确定蛋白质含量。BCA法在操作上相对简单，同时具有较高的灵敏度和较低的蛋白质样品消耗量。 除了上述常用方法外，还有其他一些蛋白质测定方法，如尿素-SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳法、氨基酸分析法等。这些方法在特定的研究领域或实验目的下具有特殊的优势和适用性。 综上所述，蛋白质含量检测是生物学研究和工业生产中不可或缺的一环。选择合适的测定方法，可以准确、快速地确定样品中的蛋白质含量，为后续实验和分析提供可靠的数据基础。同时，不同的检测方法可以相互补充，根据实际情况选择合适的方法，可以获得更加准确和全面的蛋白质含量信息。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理 蛋白质是生物体内重要的基础结构和功能分子，其含量的测定对于生物学和医学研究具有重要意义。目前常用的蛋白质含量测定方法主要包括生物化学法、生物物理法和免疫学法等。下面将对这几种方法的原理进行详细介绍。 1. 生物化学法： 生物化学法通过酶促反应或化学反应，将蛋白质转化成可以测定的可溶物或在一定条件下呈现特定吸光度的产物，从而测定蛋白质的含量。常用的生物化学法有Lowry法、Bradford法和BCA法。 (1) Lowry法： Lowry法是1969年由Lowry等人开发的一种蛋白质定量方法。该方法利用蛋白质与Folin-Ciocalteu试剂在碱性条件下发生氧化反应，生成具有最大吸收峰的蓝色产物，通过测定产物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。 (2) Bradford法： Bradford法是Bradford于1976年提出的一种测定蛋白质含量的方法。该方法基于蛋白质与染料(Coomassie Brilliant Blue G-250)之间的特异结合，蛋白质和染料形成一个蛋白质-染料复合物，该复合物的吸光度变化与蛋白质的浓度呈正相关。通过测定复合物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(3) BCA法： BCA法是一种在碱性条件下，将蛋白质还原成具有强吸收的蓝色离子的方法。BCA试剂(含有琥珀酸铜II配合物和增强剂)能与蛋白质中的酸性氨基酸残基(尤其是含有两个以上连续胺基的肽键)发生氧化还原反应，生成具有强吸收的蓝色离子。利用光密度测定产生的蓝色离子与一系列标准溶液进行比较，即可确定蛋白质的含量。 2. 生物物理法： 生物物理法是通过光学原理，利用蛋白质溶液对光的吸收、散射或旋光等性质进行测定，来间接推算蛋白质的含量。常用的生物物理法有紫外吸收光谱法、比色法和荧光法等。 (1) 紫外吸收光谱法： 紫外吸收光谱法是通过蛋白质在紫外光区域的吸收特性来测定蛋白质的含量。蛋白质中主要是由氨基酸组成，而氨基酸中的芳香族氨基酸(如酪氨酸、酪醇酸和苯丙氨酸)在紫外区域有特征性的吸收峰，通过测定吸光度与一系列已知浓度的标准溶液进行比较，即可确定蛋白质的含量。 (2) 比色法： 比色法是通过蛋白质溶液的吸光度与一系列已知浓度的标准溶液进行比较，来测定蛋白质的含量。常用的比色法有巴氏碱溶胶法、Ninhydrin法和Biuret法等。
蛋白质定量的方法
蛋白质定量的方法 蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于理解生物体的结构和功能具有重要意义。因此，准确测定蛋白质的含量是许多生物科学领域研究的基础。目前，人们已经发展出了多种方法来定量蛋白质的含量。本文将介绍几种常用的蛋白质定量方法及其原理、优缺点和应用范围。 1. 高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）HPLC是一种常用的蛋白质分离和定量方法。它利用样品中蛋白质与流动相在分离柱中的相互作用来实现分离和定量。HPLC方法的优点是分离效果好、重复性好、能够同时检测多个样品。但是，该方法需要相对较高的设备要求和操作技巧，对样品预处理也较为复杂，且比较耗时。 2. 比色法 比色法是一种常用的定量蛋白质的方法。其中，低里氏试剂法和双硫键试剂法是比较常用的比色法。低里氏试剂法是通过蛋白质与龙氏试剂（碱性铜硫脲）之间的比色反应来定量蛋白质含量。双硫键试剂法则是通过蛋白质与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）之间的比色反应来定量蛋白质含量。比色法具有操作简单、设备要求低等优点，但是对于不同类型的蛋白质，比色反应的敏感度和选择性可能不同。 3. 显微波特光度法（Bradford法） Bradford法是一种常用的蛋白质定量方法，基于酒红素（Coomassie Brilliant
Blue G-250）与蛋白质之间的相互作用产生的颜色变化。蛋白质与酒红素结合后，溶液的吸收光谱发生变化，可测量溶液的吸光度来定量蛋白质含量。该方法操作简单快捷，而且灵敏度较高，适用于常规蛋白质定量。 4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE） SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定量方法，可以通过电泳分离蛋白质并定量。该方法通过将样品中的蛋白质在电场中进行分离，然后通过比色或者近红外成像等方法来定量。这种方法对于筛选多个样品的蛋白质含量非常有用，但是需要相对较高的设备要求和操作技巧。 除了上述方法外，还有一些新兴的蛋白质定量方法，如质谱法、免标记法和荧光法等。其中，质谱法利用质谱仪来测量蛋白质中特定的质荷比，从而推断出蛋白质含量。免标记法则利用荧光或者近红外技术来实现定量，避免了标记物对蛋白质结构和性质的影响。 总之，蛋白质的定量方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。在选择蛋白质定量方法时，需要根据具体的实验目的、样品特点和实验条件综合考虑。
4种蛋白组分的测定
4种蛋白组分的测定 引言 蛋白质是生物体中最重要的大分子有机化合物之一，对维持生命活动起着重要的作用。蛋白质的组成非常复杂，不同种类的蛋白质具有不同的结构和功能。测定蛋白质的组分可以帮助我们更好地了解生物体的生理状态和疾病的发生机制。本文将介绍4种常用的蛋白组分测定方法，包括总蛋白测定、血清白蛋白测定、血清球蛋白测定和尿液微量白蛋白测定。 1. 总蛋白测定 总蛋白测定是一种常用的测定方法，用于确定生物样品中所有蛋白质的总含量。常用的总蛋白测定方法有比色法和免疫测定法。 1.1 比色法 比色法是一种通过测定蛋白质与某种试剂反应后产生的比色反应来确定蛋白质含量的方法。常用的比色试剂有布拉德福试剂和比昂斯基试剂。具体操作步骤如下： 1.取一定量的生物样品，将其与比色试剂混合。 2.等待一定的反应时间，使蛋白质与试剂充分反应。 3.使用分光光度计测定反应液的吸光度。 4.根据吸光度与已知标准曲线的关系，计算出样品中蛋白质的含量。 1.2 免疫测定法 免疫测定法是一种利用抗体与特定蛋白质结合的特异性来测定蛋白质含量的方法。常用的免疫测定方法有酶联免疫吸附测定法（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。 ELISA方法的操作步骤如下： 1.在微孔板上涂覆特定抗体，使其与待测蛋白质结合。 2.加入待测样品，使样品中的蛋白质与已固定的抗体结合。 3.加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体，使其与待测蛋白质结合。 4.加入底物，使辣根过氧化物酶催化产生发色反应。 5.使用分光光度计测定发色液的吸光度。 6.根据吸光度与已知标准曲线的关系，计算出样品中蛋白质的含量。 2. 血清白蛋白测定 血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质之一，对维持血浆渗透压和运输物质起着重要作用。血清白蛋白测定可以用于评估肝功能和营养状况。
蛋白质的含量测定方法
蛋白质的含量测定方法 一、前言 蛋白质是生命体中不可或缺的重要组成部分，对于研究生命科学、医学、农业等领域都有着极为重要的意义。因此，蛋白质含量测定方法也就成为了这些领域研究的基础之一。本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法，并详细说明其原理及操作步骤。 二、生物素-琼脂糖凝胶电泳法 1. 原理 生物素-琼脂糖凝胶电泳法是一种常用的半定量分析方法，其原理是利用琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电泳将样品中的蛋白质分离出来，并利用生物素与特异性抗体结合进行检测。由于该方法操作简便，需要样品较少且具有较高的灵敏度和特异性，因此被广泛应用于各个领域。 2. 操作步骤 (1) 制备琼脂糖凝胶：按比例配制琼脂糖溶液并加入适量缓冲液，混合
均匀后加热至溶解，然后冷却至50℃左右，倒入凝胶模具中制备琼脂糖凝胶。 (2) 样品处理：将待测样品加入适量的缓冲液中，使其浓度适当稀释。 (3) 电泳：将处理好的样品加入琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。电泳条件需要根据不同实验目的进行调整。 (4) 转移：将分离出来的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上并进行固定。 (5) 检测：利用生物素与特异性抗体结合进行检测。可以使用化学发光、荧光等方法进行检测。 三、Bradford法 1. 原理 Bradford法是一种广泛应用于蛋白质含量测定的方法，其原理是利用染料染色反应来检测样品中的蛋白质含量。该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，并且可以适用于各种类型的样品。 2. 操作步骤
(1) 制备标准曲线：按比例配制标准蛋白质溶液，并利用Bradford染料对其进行染色反应，制备出标准曲线。 (2) 样品处理：将待测样品加入适量的缓冲液中，使其浓度适当稀释。 (3) 加染料：将Bradford染料加入处理好的样品中进行反应。 (4) 摇动混合：将反应溶液摇动混合均匀。 (5) 测量吸光度：利用分光光度计测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。 四、Lowry法 1. 原理 Lowry法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用酚-硫酸反应来检测样品中的蛋白质含量。该方法操作简便、灵敏度高、特异性好，并且可以适用于各种类型的样品。 2. 操作步骤 (1) 制备标准曲线：按比例配制标准蛋白质溶液，并利用酚-硫酸反应
测定蛋白质含量的方法和原理
测定蛋白质含量的方法和原理蛋白质是生物体内最为重要的有机分子之一，对于了解生物体的结 构和功能至关重要。因此，准确、精确地测定蛋白质含量是生物化学 研究中的关键一步。本文将介绍常用的测定蛋白质含量的方法和其原理。 一、低里德伯法（Lowry法） 低里德伯法是测定蛋白质含量的常用方法之一。其原理基于酚在碱 性条件下与蛋白质发生反应，在存在重铬酸钾的条件下生成一种带有 吸收峰的蓝色化合物。这种蓝色化合物在750 nm波长处有最大的吸光度，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。 二、比色法 比色法是测定蛋白质含量的常用方法之一。常用的比色剂有布拉德 福法和加伦氏法。布拉德福法主要原理是根据蛋白质中含有的酪氨酸、酪氨酸衍生物等组分在碱性条件下与染料结合，形成有色产物，利用 比色计测定产物的吸光度从而测定蛋白质的含量。 三、BCA法 BCA法是一种基于铜离子的氧化还原反应的方法。其原理是在碱性条件下，蛋白质中的蛋白质-联没有的二瓣基色团（BCA）与四氢呋喃（THF）结合，生成紫色的螯合物。这种紫色螯合物的吸光度与蛋白 质的含量成正比，可以通过比色计测定吸光度值来确定蛋白质含量。
四、荧光法 荧光法是一种基于蛋白质与荧光染料之间的相互作用的测定方法。 常用的荧光染料有吖啶橙、铜铁磺胺二异硫氰酸盐（Ferrozine）等。这些荧光染料在特定的pH值和溶液中与蛋白质发生作用，产生荧光信号。利用荧光光谱仪测定荧光强度，通过标准曲线得出蛋白质的含量。 五、生物传感器法 生物传感器法是利用生物传感器对蛋白质的特异性识别和反应进行 测定的方法。常用的生物传感器包括酶传感器、抗体传感器等。这些 传感器可以通过与蛋白质结合形成复合物或发生反应，产生信号。利 用信号的强度可以测定蛋白质的含量。 六、尿素与氨基酸分析法 尿素与氨基酸分析法是通过测定蛋白质降解产生的尿素和游离氨基 酸来推测蛋白质的含量。该方法基于蛋白质降解后，其氨基酸经氧化 反应生成尿素，通过检测尿素或游离氨基酸的浓度来间接测定蛋白质 含量。 综上所述，测定蛋白质含量的方法多种多样，每种方法都有其适用 的场景和特点。选择合适的方法，根据具体的实验需求进行蛋白质含 量的测定，可以为后续的实验和研究提供准确和可靠的数据。
6种方法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产 生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借 蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以 甘氨酸为例，其反应式如下：NH2 CH2 COOH+3H2 SO4―― 2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2 SO4――(NH4)2 SO4(2)(NH4)2 SO4+2NaOH―― 2H2 O+Na2 SO4+2NH3(3)反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装 置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所 得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。二、双缩脲法(biuret法)(一)实验原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接 的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫 色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同 的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因 此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二)试剂与 器材1.试剂：(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪 蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮 含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清 蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05NaOH配制。(2)双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuSO4•；5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•； 4H2O)，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀释到 1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存 瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2.器材：可见光分光光度计、大试管 15支、旋涡混合器等。(三)操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，