磷脂酰丝氨酸合酶酶活测定方法

磷脂酰丝氨酸合酶（pss)酶活测定方法

1.pss催化的转酯反应

取1ml 酶液进行反应, 利用HPLC 外标法测定产物磷脂酰丝氨酸生成量, 从而计算底物大豆卵磷脂的转化率。6h 后, 测定转酯反应共生成的磷脂酰丝氨酸量。

在本实验中, 酶活反应在下述体系中进行反应: 30ml 的0.1mol/L 醋酸钠缓冲液( pH5.5) 中含有0.15mol/L 丝氨酸, 同时加入1ml 纯化后的重组磷脂酰丝氨酸合成酶, 与15ml含有0.75mmol 卵磷脂的氯仿行混合, 在30℃下200r/min 混合得到均匀的乳状液进行反应。反应6h 后, 停止转动, 双液相静止分层。提取1ml 有机相, 经挥发后, 剩余物经氯仿洗涤两次, 最后溶解于50μl 氯仿中,HPLC 法分析产物生成量。采用的流动相为乙腈: 甲醇: 85%磷酸=100: 10: 0.8, 检测波长206nm, 样品进样量15μl, 流速为1.0ml/min, 利用外标法( 以磷脂酰丝氨酸标准品为外标物) 计算底物卵磷脂的转化率。

磷脂酰丝氨酸合成酶的酶活定义为: pH5.5、30℃下, 每小时转化1μmol 大豆卵磷脂所需要的酶量( mg) 。

2.酶联比色法

pss催化水解L-α-卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在A=500nm下具有吸光值。

反应体系：将220mg的L-α-卵磷脂溶于含有3mL50mM的SDS

溶液、6mL1MNaOAc缓冲液（pH=8.0)、39mL的去离子水、0.272mL17.9%的乙醇溶液（终浓为1%）的混合体系作为底物溶解液。将39mg4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化酶溶于5.5mL的100mM Tris HCl (pH=8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2.4mL底物溶液、0.3mL的500mM CaCl2 溶液、0.2mL的去离子水混合并置于35℃反应10min,沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0.05mL 2M Tris HCl (pH=9)缓冲液，混合并离心后，上清用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液2mL与0.1mL胆碱显色剂、0.1mL胆碱氧化酶溶液室温反应2.5h.在反应混合物中加入2.0mL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶液，最后于A500nm 检测吸光值。

酶活定义：pH=8.0、T=35℃时，磷脂酰丝氨酸合成酶1h内催化水解L-α-卵磷脂释放1.0μmol的胆碱所需要的酶量。