常见食用豆类中黄酮类化合物含量的测定

用移液管准确吸取５ ｍＬ食用豆类提取液置于 ２５ ｍＬ容量瓶中，加入０．７ ｍＬ ５％ＮａＮ０２，摇匀，放置 ５ ｍｉｎ后，加入０．７ ｍＬ １０％硝酸铝，６ ｍｉｎ后再加入 ５ ｍＬ ｌ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠，混匀，用７５％乙醇定容， １０ ｒｎｉｌ屑在５１０ ｎｍ处比色测定。用芦丁作标样，配 制不同浓度的标样溶液，绘制标准曲线，根据标准曲 线计算食用豆类中的黄酮总量［１０］。 １．２．３食用豆类中大豆异黄酮总含量的测定
２００９年第７期
豆为０．５０１ ｍｅ／ｇ（每克脱脂豆粉中所含的黄酮类），其 含量由大到小的顺序为：赤豆＞黑小豆＞绿豆＞刀 豆＞黑大豆＞饭豆＞豇豆，而另外８种食用豆：小扁 豆、绿大豆、蚕豆、大豆、芸豆、豌豆、麻豇豆、鹰嘴豆 则未检出黄酮类。 ２．１．２硝酸铝显色法黄酮总量测定结果
硝酸铝显色法黄酮总量测定结果见表２。
采用氯化铝显色法、硝酸铝显色法分别测定了
收稿日期：２００８—０７—０８ 作者简介：任顺成，男，１９６３年出生，副教授，博士，硕士生导师，
天然活性成分及其功能评价
万方数据
１５种常见食用豆类中的黄酮类化合物总含量，应用 直接测定法测定食用豆类中异黄酮的总含量，利用 高压液相色谱法对样品中的４种大豆异黄酮单体含 量进行了测定。为评价食用豆类的保健功能以及为 优良品种的选育、栽培提供参考。
食用豆类是以收获籽粒兼做蔬菜供人类食用的 豆科作物的统称。食用豆类不仅是重要的粮食资源 之一，而且具有很高的营养价值。食用豆类中除含 有丰富的油脂和优质蛋白以外，还含有多种生物活 性物质，其中含有多种维生素，矿物质以及黄酮类化 合物［１｜。
黄酮类又称生物类黄酮，为植物多酚类的代谢 物，是广泛存在于自然界的一大类化合物，大多有颜 色。黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、 抗衰老、抗骨质疏松、抗肿瘤等多种生物活性，是重 要的食品添加剂和营养强化剂…２。其中大豆异黄酮 作为黄酮类化合物中的异黄酮成分，其分子结构骨 架是３一苯色原酮，目前发现的大豆异黄酮主要有１２ 种，分为三大类，即大豆苷类（Ｄａｉｄｚｉｎ Ｇｒｏｕｐｓ）、染料木 苷类（Ｇｅｎｉｓｔｉｎ Ｇｒｏｕｐｓ）、大豆黄素苷类（Ｇｌｙｃｉｔｉｎ Ｇｒｏｕｐｓ），以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、 丙二酰基葡萄糖苷型等４种形式存在，其中游离型 占总量的２％一３％［３１。大豆异黄酮具有明显的抗氧 化作用，药理学研究表明大豆异黄酮可作为雌性激 素治疗替代品，能改善妇女更年期综合症，并有效 降低血胆固醉含量，防止骨质疏松及抑制癌细胞增 长等［４｜。
２００９年７月 第２４卷第７期
中国粮油学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｒｅａｌｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
Ｖ０１．２４．Ｎｏ．７ Ｊｕｌ．２００９
常见食用豆类中黄酮类化合物含量的测定
任顺成 王 鹏 王国良 马宇翔 陈丽兰
（河南工业大学粮油食品学院，郑州４５００５２）
摘要 以芦丁为标样应用氯化铝显色法、硝酸铝显色法分别测定１５种常见食用豆类中的黄酮类化合
物总含量，以染料木素做为标样应用直接比色法测定其中食用豆类样品中异黄酮的总含量，利用高压液相色
谱法测定常见食用豆类中的４种大豆异黄酮单体成分的含量。结果表明：使用氯化铝显色法进行测定，赤豆、
绿豆等７种食用豆类显示合有黄酮类化合物，并且含量最多的赤豆为０．５０１ ｍｇ／ｇ。硝酸铝显色法测定豆类样
１ 材料与方法
１．１材料与仪器
大豆、黑小豆、绿大豆、黑大豆、蚕豆、绿豆、红小
豆、刀豆、芸豆、饭豆、麻豇豆、豌豆、花豇豆、小扁豆
和鹰嘴豆：市售。
’
芦丁标样：分析纯，上海华硕精细化学品有限公
司；大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素：标样，纯
度ｉ＞９８％，美国ｓｉｇｎａ公司。 ＷＦＺ ＵＶ一２０００型紫外分光光度仪：尤尼卡（上
大豆０
黑小豆０．４０３
黑大豆０．１４０
芸豆０
豆类样品
黄酮争量
ｒａｇ／ｇ
花豇豆０．００９
刀豆０．３０４
豌豆０
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
麻豇豆０
绿豆０．３５９
饭豆０．１１８
鹰嘴豆０
由表１可知，使用氯化铝显色法进行测定时，只 有赤豆、黑小豆、黑大豆、豇豆、刀豆、绿豆、饭豆７种 食用豆显示含有黄酮类化合物，并且含量最多的赤
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中国粮油学报
品黄酮类总合量为０．２９７～８．８４４ ｍｇ／ｇ。直接比色法测定食用豆类中异黄酮总含量为１．９９４—８．８４０ ｍｇ／ｇ。高
压液相色谱法测定４种大豆异黄酮单体成分的总含量为０．０３１～３．３４５ ｍｇ／ｇ。
关键词食用豆类黄酮类异黄酮 比色法高压液相色谱
中图分类号：ＴＳ ２１４
文献标识码：Ａ
文章编号：１００３—０１７４（２００９）０７—０１３２—０６
海）仪器有限公司；ＬＣ卜１０Ａｔ、，ｐ型高效液相色谱仪、
ｓＰ卜１０Ａｖｖｐ型紫外检测器、ｓｃＬ＿１０Ａ、ｒｐ型系统控
制器、ＣＴＯ－－１０Ａｓｖｐ型柱温箱：日本岛津公司。
１．２试验方法
１．２．１食用豆类中黄酮类化合物的提取
将食用豆类样品粉碎，过４０目筛，以石油醚在
６５℃温度下回流脱脂１ ｈ，抽滤后放在５０℃左右的
从上述两种比色方法测定结果可以看出，三氯 化铝和硝酸铝显色法测定的结果差异较大，主要是 由于各样品中黄酮类类型不同以及两种显色方法的 显色机理不同造成的。
三氯化铝显色法反应原理：黄酮类化合物的甲 醇（或乙醇）溶液中加入三氯化铝试剂时，能使黄酮 酚羟基离解或形成络合物，导致吸收光谱变化。三 氯化铝可与具有３一羟基、４一羰基或５一羟基、４一 羰基的黄酮或黄酮醇类化合物作用，也能与Ａ环或Ｂ 环上的邻二酚羟基作用生成黄酮铝配合物，使吸收 带红移，但邻二羟基与三氯化铝形成的络合物没有 ３一羟基、４一羰基或５一羟基、４一羰基形成的络合物 稳定。此外一些黄酮类物质如异黄酮类、黄烷酮、儿 茶素等在可见区和三氯化铝作用不显色，这可能会 使测定结果偏低。由于大豆、绿大豆、黑小豆等中可 能主要含异黄酮类化合物，不能与三氯化铝发生显 色反应，使测定结果几乎为零。其它豆类中所含的 大部分黄酮类化合物也不具备此显色法所需结构，
烘箱里干燥，备用。准确称取脱酯豆粉５．０ ｇ，用 ７５％的乙醇，以１ ｇ ５ ｍＬ的料液比，在６０℃温度下， 浸提２ ｈ，冷却后，用循环水式真空泵进行抽滤，最后
再用中速滤纸过滤，得到澄清的提取液，定容在
第２４卷第７期
任顺成等常见食用豆类中黄酮类化合物含量的测定
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５０ ｍＬ的容量瓶中，备用［５—６Ｊ。 １．２．２食用豆类中黄酮总量的测定 １．２．２．１氯化铝显色法测黄酮含量
用移液管准确吸取１ ｍＬ食用豆类提取液置于 ２５ ｍＬ容量瓶中，加２０ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ三氯化铝，定容， 摇匀，１０ ｍｉｎ后在４１９ ｎｉｎ处比色测定吸光值。用芦 丁作标样，配制不同浓度的标样溶液，绘制标准曲 线，根据标准曲线计算食用豆类中的黄酮总量［７—９｜。 １．２．２．２硝酸铝显色法测黄酮含量
用移液管准确吸取１ ｍＬ提取液于２５０ ｍＬ容量 瓶中，７５％乙醇定容，摇匀，１０ ｍｉｎ后直接在２７０ ｎｒｆｌ 处测定其吸光值。以染料木素作标样，配制不同浓 度的标样溶液，绘制标准曲线，根据标准曲线计算大 豆异黄酮的总量【１１ Ｊ。 １．２．４高压液相色谱法测定大豆异黄酮单体含量 １．２．４．１样品处理
万方数据
定色谱条件下分别将上述不同浓度标样注入ＨＰＬＣ 进行分析，以浓度和峰面积作图，分别得到大豆苷、 大豆苷元、染料木苷及染料木素等标样标准曲线图， 根据标准曲线及标样色谱图中的保留时间分别计算 大豆异黄酮单体的含量。
２结果与讨论
２．１食用豆类中黄酮总量 氯化铝显色法、硝酸铝显色法的标准曲线见图１
将５ ｍＬ提取液定容至２５ ｍＬ。摇匀后过０．４５
胛滤膜，滤液转入高压液相色谱专用小瓶中，用液
相色谱分析提取液中大豆异黄酮单体的含量。 １．２．４．２色谱分析条件
流动相：甲醇：０．５％醋酸溶液３０％～７０％梯度 洗脱；色谱柱：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ一３柱（４．６ ｔｏｎｉ×２５０ ｍｍ）； 检测波长：２５４ ｎｍ，柱温：５０℃，流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，分 析时间：２０ ｍｉｎ。 １．２．４．３异黄酮定性定量方法
髫
标样色谱图及标准曲线见图４一图１１。根据其
标准曲线分别计算食用豆类中大豆异黄酮单体含 量。
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幽 罾Ｏ．
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表２硝酸铝显色测定黄酮含量
豆类样品 赤豆
黄酮拿量
ｒａｇ／ｇ
７．７４２
小扁豆
２．２７６
绿大豆０．４６９
蚕豆
１．５５２
大豆
０．５７２
黑小豆
５．５８７
黑大豆
１．７８１
芸豆
２．５８９
豆类样品考篡多尹
花豇豆
５．８１７
刀豆
１．５２７
豌豆０．３８１
麻豇豆８．８４４
绿豆０．９４９
饭豆
３．３７８
鹰嘴豆
Ｏ．２９ｒ７
由表２可知，１５种豆类中均含有黄酮类，含量为 ８．８４４～０．２９７ ｍｇ／ｇ。其中，麻豇豆的含量最高为 ８．８４４ ｍｅ／ｇ；鹰嘴豆的含量最低为０．２９７ ｍｇ／ｇ。其含 量由大到小的排序为：麻豇豆＞赤豆＞豇豆＞黑小 豆≥饭豆＞芸豆＞小扁豆＞黑大豆＞刀豆＞蚕豆＞ 绿豆＞大豆＞绿大豆＞豌豆＞鹰嘴豆。 ２．１．３两种显色方法测定结果的比较
染料木素法的标准曲线见图３，根据其标准曲线 计算食用豆类中的大豆异黄酮总量。
染料木素浓度／ｔ－＇ｇ／ｍＬ 图３染料木素标准曲线
食用豆类中大豆异黄酮总量测定结果见表３。
表３直接比色法测定异黄酮总含量
豆类样品
黄酮争量
ｍｅ，／ｇ
豆类样品
黄酮含量ｍｅ／ｇ
赤豆
３．４１３
小扁豆
２．７６９
绿大豆
５．２４１
蚕豆
７．２７５
万方数据
使测定结果较低。 硝酸铝显色法反应原理：硝酸铝显色法是先用
ＮａＮ０２还原黄酮类，再与ＡＰ＋络合，最后在ＮａＯＨ碱 性条件下使黄酮类化合物开环，生成２ ７一羟基查耳 酮而显色，在波长５１０ ｎｌｎ左右有最大吸收，非黄酮类 成分在此波长不具有吸收。与ＮａＮ０２一Ａ１（Ｎ０３）３一 ＮａＯＨ试剂反应后，某些黄酮类物质（如黄芩苷、黄芩 素、香蒲新苷、山奈酚、槲皮素、橙皮苷等）在５１０ ｎｍ 处无最大吸收或吸收很弱，而某些非黄酮类物质（如 咖啡酸、原儿茶醛、绿原酸、原儿茶酸等）在５１０ ｌｌｍ处
以大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素作为 标准样品，根据豆类提取物液中大豆异黄酮成分色 谱峰的保留时间与标样色谱峰的保留时间进行定 性。根据提取液高压液相色谱中各组分峰面积与各 标样峰面积的标准曲线对样品中４种大豆异黄酮单 体含量进行测定［１２－１ ３｜。 １．２．４．４标准曲线绘制
准确称取一定量标样（大豆苷、大豆苷元、染料 木苷及染料木素）用高级色谱纯甲醇溶解，稀释至 １０ ＩＩｌＬ的容量瓶中。经０．４５ ｔｕｎ滤膜过滤后，分别稀 释一定倍数后转入高效液相色谱专用小瓶中，在选
第２４卷第７期
任顺成等常见食用豆类中黄酮类化合物含量的测定
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为８．８４０ ｍｅ／ｇ；豌豆的含量最低，为１．９９４ ｍｇ／ｇ。其 含量由大到小的排序为：黑小豆＞大豆＞蚕豆＞黑
大豆＞绿大豆＞绿豆＞麻豇豆＞豇豆＞赤豆＞刀豆
＞饭豆＞芸豆＞小扁豆＞鹰嘴豆＞豌豆。
齄 喧
２．２．２食用豆类中大豆异黄酮单体含量测定结果
有最大吸收或吸收较强，说明此方法专屙陛不强，有
局限性，准确性较差。经过试验证明，以ＮａＮ０２一Ａ１ （Ｎ０３），一ＮａＯＨ为显色体系，于５１０ ａｍ处测定食用 豆类中总黄酮含量与其他方法相比结果偏高，可能 是因为食用豆类里含有许多在此处显色的非黄酮类 物质，引起结果偏高【１４Ｊ。 ２．２食用豆类中大豆异黄酮含量测定结果 ２．２．１食用豆类中大豆异黄酮总量测定结果
～图２，根据其标准曲线分别计算食用豆类中的黄酮 总量。
ｊ翌 兴 整
Ｏ
芦丁浓度／ｍｇ／ｍＬ 图１氯化铝显色法标准曲线
图２硝酸铝显色法标准曲线
２．１．１氯化铝显色法黄酮总量测定结果 氯化铝显色法黄酮总量测定结果见表１。
表１氯化铝显色法测定黄酮含量
豆类样品
黄酮亨量 “ｇ／ｇ
赤豆０．５０１
小扁豆０
绿大豆０
蚕豆０
大豆
７．９３３
黑小豆８．８４０
黑大豆
６．５１４
芸豆
２．８４２
豆类样品
豆类样品 花豇豆 刀豆 豌豆 麻豇豆 绿豆 饭豆 鹰嘴豆
黄印声量
／ｍｇ／ｇ
黄酮含量 ３．５３０
３．１５０ １．９９４
３．７４９ ４．２０６ ２．９５９ ２．７３４
由表３可知，１５种食用豆类中均含有异黄酮，含 量为８．８４０～１．９９４ ｍｇ／ｇ。其中，黑小豆的含量最高，