细胞工程第四章 植物组织器官培养技术

(二)茎尖培养脱毒
1.茎尖培养脱毒原理
染病植株体内病毒的分布不均匀，越靠 近茎顶的感染深度越低，生长点（约0.1 －1.0mm）几乎不含或含病毒很少。
原因:无维管束，病毒只能通过胞间连丝 传递，不及细胞不断分裂和生长的速度。 因此可利用微茎尖培养脱毒。
茎尖大小与脱毒效果。 茎尖培养的脱毒效果与茎尖大小呈反比; 茎尖培养的成活率与茎尖大小呈正比。 思考：什么样的茎尖大小合适？
▪ 愈伤组织增殖的特点是成功率高，繁殖系 数大，但遗传稳定性较差。
▪ 3．生根培养
▪ 4．生产用苗的培植
▪ （二）离体繁殖的使用范围
▪ 离体繁殖常用于以下几个方面：
▪ 某些难以繁殖或繁殖系数很低的植物
▪ 某些需要加速繁殖的特殊基因型如名贵花卉、 优良资源、果树芽变体和转基因植株等
▪ 自然无性繁殖极易感染病毒的植物如马铃薯、 甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等
▪ 培养：22℃左右，每天以16h、1500－ 5000lx光照下培养。保证较高温度和充足 光照时间。
▪ 继代、生根培养：同器官培养。
3.培养基与培养方式 常用培养基： MS White、Morel
适当提高生长素（0.1－0.5mg/L）与细 胞分裂素浓度。有时可加活性炭。用NAA或 IBA，Kt或BA， 不用2,4－D。 GA适当。
▪ 思考：热处理的作用是什么？
▪ 2.热处理方法：
▪ 温汤（浸渍）处理：适用于离体材料（如 接穗）和休眠器官的处理。在50 ℃左右的 温水中浸渍10min至数小时，使病毒失活。
热风（热空气）处理 恒温处理：将生长的盆栽植物移入温热疗
室内，一般在35－40 ℃ 。对活跃生长的 茎尖效果较好，处理时间因植物而异。 ▪ 变温处理：如马铃薯每天40 ℃处理4h，可 清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持 芽眼的活力。 ▪ 缺陷：不能脱除所有病毒。例如在马铃薯 中只能消除卷叶病毒。 注：热处理需与 其它方法配合应用
几百倍），其繁殖速度是任何其它方法所
不能比拟的，所以通常将组织培养繁殖称
之为快繁(rapid clonal propagation)。
这就大大地加快了优良品种的推广速度 。
▪ 4．节约耕地，提高 农产品商品产出率
▪ 对于那些以块根、 块茎、鳞茎为繁殖器 官的作物来讲，每年 相当一部分产品要用 作留种。如：
▪ 分化是指植物体各个部分出现异质性的 现象，可以在细胞水平、组织水平或器官水 平上表现出来
细胞全能性
脱分化
细胞分裂
再分化
个体再生
细胞全能性的表达是通过脱分化和在分化 实现的，在大多数情况下，脱分化是全能性表 达的前提，再分化是全能性表达的最终体现
脱分化也称去 分化，是指离体培 养条件下生长的细 胞、组织或器官经 过细胞分裂或不分 裂逐渐失去原来的 结构和功能而恢复 分生状态，形成无 组织结构的细胞团 或愈伤组织或成方 未分化细胞特性的 细胞的过程。
▪ 有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无 性繁殖的植物
▪ （三）离体繁殖的遗传变异与控制 ▪ 1．外源生长调节剂对品种典型性的影响
▪ 2．继代次数与变异
▪ 3．增殖方式的合理选择
第四节 花药及花粉培养
▪ 一、基本概念与意义
▪ 花药培养指应用组织培养技术，将花粉 发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上 进行培养，以诱导其花粉粒改变发育进程， 形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的技 术。
▪ 4.影响微茎尖培养的因素
▪ 外植体大小： 通常以带1-3个幼叶原基的 茎尖（约0.3-0.5mm)作外植体为宜。不同 植物脱毒适宜的茎尖大小不同。
▪ 培养条件：增加光照
▪ 外植体的生理状态 茎尖最好在活跃生长的 芽上切取， 取芽的时间最好是在萌动期较 好。
▪ 三、离体繁殖
▪ 离体繁殖(propagation in vitro)是在人工 控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上 繁殖的技术。
▪ ①芽增殖特点主要 表现在培养方法简 单，能高度保持遗 传稳定性，能长期 继代繁殖。目前采 用这一方式快速繁 殖的植物有石竹、 马铃薯、甘薯、草 莓、葡萄和月季等。
▪ ②不定芽增殖 从 现存的芽以外的任 何器官和组织上通 过器官发生重新形 成的芽称之为不定 芽。
▪ 特点主要表现在繁 殖系数高，有较好 的遗传稳定性。
型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。
（二）实现植物细胞全能性的条件
参照动物细胞研究分类类型，植物细胞也可分为三类
第一类是茎尖、根尖及形成层细胞，这类细胞始终 保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期，为周期细 胞。
第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞， 他们为永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞。
带1-3个叶原基的茎尖（0.3-0.5mm）作为外 植体。
2.茎尖培养方法
材料选择、消毒 微茎尖的剥取 接种
▪ 材料选择、消毒： 在植株上直接取或在 室内培养一段时间的植株上取顶芽或侧芽 然后消毒（或不消毒）。
▪ 微茎尖的剥取： 解剖镜下剥取。注意勿 损伤生长点。
▪ 接种：随剥随接，尽快接种。
诱导愈伤组织形成
愈伤组织胚性化
子叶胚期
球形胚期
▪ 综上所述，植物细胞组织培养的全过程 可以简单描述如下
脱分化 外植体（细胞）
愈伤组织 再 分 化
完整植株
体细胞胚和 不定器官
第二节 植物组织培养的基本步骤
一、无菌外植体的获得 1. 0.1％—0.2 ％氯化汞（2—10分钟） 2. 70 ％酒精数秒，转入10 ％氯化钙（2—
▪ ①大蒜 留种量 占产量的1/5~1/8。
▪ ②马铃薯 留种 量占产量的1/10。
▪ ③贝母 留种量 占产量的1/3。
▪ 二、植物脱毒的原理和技术
▪ （一）热处理脱毒（温热疗法）
▪ 1.原理：当植物组织处于高于正常温度的 环境（35-40℃）时伤害。
愈伤组织
再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与 原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官 的过程。
（1）培养的植物细胞或组织的脱分化，形成 愈伤组织。 （2）由新形成的愈伤组织形成一些分生细胞， 随后由其分化成不同的器官 原基。
（四）离体培养中再生植株的两条途径
（1）器官发生方式：
先芽后根
▪ ③胚状体增殖 特点是增长率高，胚的双 极性免去了生根环节，但胚状体休眠的诱 导和解除还难以把握，其成苗率还不高。 因此，目前除一些特殊用途外(人工种子)， 这一技术途径还没有用于植物的快速繁殖。
▪ ④愈伤组织增殖 可以说，所有的植物通 过组织培养的方法均可以诱导形成愈伤组 织,愈伤组织再进一步分化即可获得小植株。
▪ ８.胚状体［embroid］：
在离体培养过 程中产生一种 形似胚（具有 明显的根端和 芽端），功能 与胚相同的结 构。
石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程
▪ 二、植物组织培养的基本原理
▪ (一)植物细胞全能性
▪
每一个植物细胞带有该植物的全部遗传信息，
在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分
化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类
第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞，这类细胞在通 常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂， 称为Go细胞。
一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。
▪ (三)植物细胞分化 ▪ 细胞分化（differentiation），是指导
致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在 发育方式改变的过程。
▪ 由植物组织或器官培养产 生愈伤组织，进而培养成
完整植株。
人工培养植物体一部分(即 外植体 ) 生成完整植株。
广义和狭义概念有何区别？ ★组培范围不同，即外植体范围不同。
2．外植体〔explant〕：从植物体分离并用于 离体培养的材料。
３.愈伤组织
在离体培养时形 成的具分生能力 的一 团不规则细 胞，多在外植体 切面上产生。
为外植体，繁殖过程在人工控制的环境条 件下，所以既不会造成性状分离，同时还 避免了病虫害的浸染，从而可以很好地保 持品种的优良特性。
▪ 2．生产无病毒种苗，防止品种退化
唐菖蒲病毒病
辣椒病毒病
▪ 3．快速繁殖新品种，加速优良品种推广
▪
离体繁殖因为周期短(1~3个月)，
不受季节限制，因此繁殖系数高（几十至
▪ 目前已有近400种植物的离体繁殖已获得成功， 其中许多具有重要经济价值的花卉(如兰花、 菊花、石竹等)、水果(如草莓、无籽西瓜、 葡萄、草莓和香蕉等)、经济作物(如马铃薯、 甘蔗等)和林木(如桉树、杨树等)等，均已建 立离体繁殖的种苗生产体系，取得了巨大的 经济效益和社会效益。
▪ （一）离体繁殖的一 般技术
10分钟）或者转入2 ％次氯酸钠（15—30 分钟）
消毒流程
二 、初代培养物的建立 1. 无菌环境 2. 规范操作 3. 条件合适
三 、形态发生和植株再生
四 培养产物的观察记载 1. 愈伤组织 2. 胚状体 3. 芽 4. 根
第三节 植物脱毒与快速繁殖
▪ 一、植物脱毒和快速繁殖的意义 ▪ 1．能够有效保持优良品种特性 ▪ 离体无性繁殖主要是以植物营养器官
▪ （2）花药材料的基因型、生理状况 （即植物种类、品种、母株年 龄、营养状况）
▪ 5.培养基的选择 ▪ （1）基本培养基：MS、N6、B5等 ▪ 注：铵盐浓度高抑制花粉愈伤组织的形成。 （2）激
素：6-BA KT、ZT，2,4-D、NAA、IAA
▪ 愈伤组织诱导：基本培养基+2,4-D 1-3 ▪ 分化培养基：基本培养基+ 6-BA 2-3+IAA0.2 ▪ -0.5 ▪ 生根培养基：生长素 0.5-1或不加。
▪ （3）蔗糖：浓度对花粉愈伤组织诱导率有影响， 多数为2-4%。诱导愈伤组织用高浓度，而愈伤组织 分化成苗用较低浓度。
▪ （4）活性炭：促进胚状体发育，提高花粉质量。
▪ （5）有机附加物：添加有机物效果好。
▪ 花粉培养则需将花粉从花药中游离出来， 再进行离体培养
花 药 及 花 粉 培 养
▪ 1．克服后代分离，缩短育种年限 ▪ 2．选择效率高 ▪ 3．有利于隐性基因控制性状的选择 ▪ 4．快速获得自交系的超雄株 ▪ 5．其他
▪ 二、花药培养技术
▪ 1 .花药培养实质： 器官培养
2.花药培养程序
① 材料预处理： 低温冷 藏、60钴照射、乙烯利 喷母株，提高出愈 率。
先根后芽
根芽同步发生
脱分化
再分化
（2）体细胞胚胎发生
▪ 离体培养下没有经过受精过程，但经过了
胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养
的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细
胞
胚
或
胚
状
体
▪ (一)植物体细胞胚胎发生过程
▪ 1．体细胞胚从外植体上直接发生
诱导阶段
胚胎发育阶段
▪ 2．经过愈伤组织的体细胞胚发生
② 表面灭菌： 70%酒精表 面擦洗或按器官灭菌方 法。
③ 接种： 接种程序见图。 ④ 注：不要直接夹花药；
接种密度宜高。
3.形成途径
▪ 4.花药材料的选择
▪ 思考：花粉发育四个时期？
▪ （1）花药培养适宜的花粉发育时期：
▪ 大多数植物－－单核期，尤其是单核中、晚期。
▪ ★花粉发育时期的检测方法： 压片染色法：采用醋酸洋红或KI染色法。 花器官形态特点观察
1.外植体的选择
(1)根据培养目的选择
(2)考虑种质、取材大 小、时期和材料的生 理状态，具有代表性
植物在自然 条件下的繁 殖特点
离体条件下茎 芽的增殖方式
外植体的取材 部位、大小和 生理状态。
▪ 2．培养物的增殖
植物的种类和自然生长习性不同，其增 殖方式及所采取的相应技术措施也不一样。 一般来讲，培养物的增殖有以下4种方式
第四章 植物组织器官培养技术
知识目标：
1. 掌握植物组织培养的基本概念和基本原理 2. 理解植物细胞脱分化与再分化现象 3. 掌握植物组织培养的基本程序。 4. 掌握植物脱毒与快速繁殖、花药和花粉培养、
植物胚胎培养和人工种子等技术。
第一节 植物组织培养的基本原理 一、植物组织培养的相关定义
1．植物组织培养概念
４.初代培养：
芽、茎段、叶片、 花器等外植体在 离体培养条件下 诱导愈伤组织、 侧芽或不定芽、 胚状体过程。
５.继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材 料（愈伤组织、芽）。
６.生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成 为完整植株的过程。
７.驯化移栽：
组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使 之适应 露地或保护地条件的过程。