海洋放线菌卤代酶的研究进展_蔡宏明
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从卤代酶研究的技术方面来说， 近年来， 基因筛选 成为寻找新化合物的重要手段。 人们可以通过将特定基 因作为筛选标记， 进而在基因水平上评估相应菌株的活 性物质产生能力这样的菌株活性和生理指标， 进而可以 筛选到在初始条件下菌株低表达或不表达的活性物质； 另一方面， 随着生物信息学的发展， 以及各种数据库的 涌现和不断完善， 通过对次生代谢产物合成相关基因进 行生物信息学分析， 通过结构的寻找和比对， 可以初步 的预测产物的结构， 在一定程度上避免化合物的重复发 现， 节省了很多时间和精力。 已经发现的卤化物质， 其 中有很高商业价值并应用于药理学领域的有氯霉素和万 古霉素等。 相信随着人们对卤代酶的底物结构和反应机 理了解的不断深入， 利用可以人为控制的生物卤化反应 合成有机卤化物， 必将在创新药物和先导化合物研究等 领域有广阔的应用前景。
1983 年 人 们 在 对 褐 藻 的 研 究 中 首 先 发 现 了 钒 的 成 分， 进而在对藻类、 苔藓和真菌中的研究中发现了含有 钒的卤过氧化物酶。 研究发现， 这种酶的活性依赖于钒 与其活性位点结合。 这种酶在 H2O2 存在时氧化卤素原子 （氯、 溴或碘） 产生自由酸作为卤化剂， 与含有血红素的 卤过氧化物酶相似。
在 对 丁 香 霉 素 E 和 抗 肿 瘤 活 性 物 质 barbamide 生物合成 研究时， 同位素标记研 究 显 示 前者的合成源于 Thr， 后者源于 Leu， 将二者的 生物合成基因簇和 FADH2 依赖型卤代酶基因相 比较并没有发现相似性。 根据某些卤代天然产 物生物合成基因簇的测序结果， 在推定的读码 框中并没有发现任 何卤代 过 氧 化 物 酶 或 FADH2 依赖型卤代酶的基因， 这暗示可能有新类型卤 代酶存在， 这类酶就 是非血 红 素 FeIIα-酮 戊 二 酸盐依赖型卤代酶。
Байду номын сангаас
这类酶具有底物特异性和很强的区域选择 性。 按底物的差异 性 ， FADH2 依 赖 型 卤 代 酶 可 以分为吲哚或色氨酸衍生物， 苯环或吡咯衍生 物两个亚类。 目前， 越来越多的研究表明在许 多抗生素的生物合成基因簇中存在 FADH2 依赖 型的卤代酶， 提示 FADH2 依赖型卤代酶是生物 卤化的主要机制。 1.3 非血红素 FeIIα-酮戊二酸盐依赖型卤代酶
近年来在卤代酶领域的发现和进展， 以期起到抛砖引玉的作用。
【关键词】 卤代酶； 放线菌； 海洋微生物； 卤化物 中图分类号： Q 93．33 文献标识码： A 文章编号： 1000-9868(2012)05-0122-03
卤化物包括氟化物、 氯化物、 溴化物、 碘化物以及 某些卤素互化物。 按组成卤化物元素的属性， 可以分为 金属卤化物和非金属卤化物。 自 1896 年从海洋菌株中分 离得到了第一个含卤素的天然化合物之后， 越来越多的 卤化物被发现。 迄今为止， 已经发现上千种的卤化物， 其中很多是重要的抗生素。
［ 3］ Van Pee K.H.. Microbial biosynthesis of halometabolites ［ J］ . Arch Microbiol， 2001， 175 （4）： 250-258.
［4］ Hemrika W.， Renirie R.， Dekker H.L.， et al. From phosphatases to vanadium peroxidases： a similar architecture of the active site ［J］ . Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94 （6）： 2145-2149.
过氧水解酶没有血红素辅基， 也不含任何金属离子， 由于其催化卤代反应的过程需要 H2O2， 因此这类酶曾经 归为卤过氧化物酶。 利 用 MCD 光 谱 分 析 法 ， van Pee 等 人从产卤化物的假单胞菌和链霉菌中分离到了这种酶。 结构研究表明， 这类酶 属于 α/β 水解酶， 生化研究表明 其活性依赖于短链羧酸。 1.2 FADH2 依赖型卤代酶 （FADH2 dependent halogenases）
1 卤代酶
根据催化机理， 将卤代酶系统分为卤代过氧化物酶 （haloperoxidases） 和黄素依赖型卤代酶 （flavin-dependent halogenases） ， 除 这 两 大 类 之 外 ， 还 有 甲 基 卤 代 转 移 酶 （methyl halide transferases） 和氟化酶 （fluorinases） 等。 1.1 卤代过氧化物酶
因为这个酶需要过氧化氢及卤素离子 （氯、 溴或碘） 来催化卤代反应， 所以被称为卤过氧化物酶。 该酶实际 上是由两个酶组成的， 其中一个是葡糖氧化酶， 另一个 是氯过氧化物酶。 由于卤过氧化物酶是胞外酶， 尽管在 体外卤过氧化物酶能催化其中间体的氯化， 却一直无法 证明卤过氧化物酶确实参与了 caldariomycin 的生物合成。
这种酶又被称为黄素依赖型卤代酶。 随着金霉素生 物合成基因簇的克隆及随后硝吡咯菌素生物合成途径被 阐明， 黄素依赖型卤代酶被发现。 该酶的核苷酸序列与 已知卤过氧化物酶、 过氧化物酶或过氧水解酶都没有相 似性。 研究表明这种黄素还原酶能从 FAD 和 NADH 产生 卤 代 酶 所 必 需 的 FADH2， 因 此 这 种 新 型 卤 代 酶 被 称 为 FADH 2 依赖型的卤代酶。
在 研 究 barbamide 生 物 合 成 途 径 时 ， Barbamide 基因簇中的 BarB1 /BarB2 与 syringomycin 基因簇中 SyrB 2 的氨基酸序列有很高的相似性， 这 类 蛋 白 属 于 一 类 非 血 红 素 Fe2+α-酮 戊 二 酸 依 赖 型 酶 ， 提示这类酶可能负责 syringomycin E 和 barbamide 合成中 的氯化， 但其催化机制尚未完全清楚。
该酶含有一个部分钒酸盐阴离子 H2VO4-， 一个羟基 位于其中轴线上， 过氧化氢攻击该羟基， 进而形成过氧
食品工程·Technique 技术
图 1 Cakdariomyces fumago 中的 含亚铁血红素氯代过氧化物酶推定的反应机理
化氢中间体， 该中间体迅速被质子化， 形成一个过氧复 合物-HVO2 （O2）， 然后卤离子和该复合物反应产生次卤 化钒酸盐。 形成的次卤酸作为真正的卤化剂导致了非酶 卤化作用， 同样导致了该卤代反应缺乏底物专一性和区 域选择性。 1.1.3 过氧水解酶 （perhydrolases）
参考文献
［1］ Berdy J.. Bioactive microbial metabolites ［J］ . The Journal of antibiotics （Tokyo）， 2005， 58 （1）： 1-26.
［2］ Hager L.P.， Morris D.R.， Brown F.S.， et al. Chloroperoxidase II utilization of halogen anions ［J］ . J Biol Chem， 1966， 241 （8）： 1769-1777.
FADH2 依赖型的卤代酶是许多抗生素生物合成基因 簇 中 的 后 修 饰 酶 。 Hornung 等 人 试 图 从 放 线 菌 中 发 现 新 的卤代酶基因， 进而发现新的抗生素合成基因簇。 试验
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技术 Technique·食品工程
结果表明， 在随机筛选的 500 株放线菌中约有 103 株 含 有潜在的FADH2 依赖型卤代酶基因。 这些研究表 明， 可 以通过寻找新的卤代酶来寻找新的含卤素抗生素。 2.3 在基因工程方面的应用
目前， 在基因工程方面， 根据卤代酶的核苷酸序列 片段设计引物， 并采用 PCR 的方法由海洋放线菌中扩增 筛选， 并进行测序鉴定， 最后使用分子生物学软件进行 分析。 研究发现海洋放线菌的阳性率远高于陆地来源的 放线菌， 可作为未来获得新卤化活性物质的一类重要微 生物资源。 而由基因方法获得的海洋放线菌中卤代酶基 因片段， 也为研究其在生物合成中的功能奠定了基础。
卤 代 过 氧 化 物 酶 首 次 被 发 现 是 在 Caldariomyces fumago 的细胞提取物里， 人们发现它可以将单氯双甲酮催 化为双氯双甲酮。 该反应可以不必确定底物而对酶活性
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进行研究， 并导致了更多卤代过氧化物酶的发现。 目前， 根据各种辅因子不同， 可以将卤代过氧化物酶分为三类： 1.1.1 含亚铁血红素的卤代过氧化物酶 （heme-containing haloperoxidases）
该酶在反应过程中被过氧化物氧化， 形成了一个中 间反应物 A， 由该中间反应物 A 对环境中的卤素离子进 行氧化作用， 形成了瞬时中间产物 B， 在低 pH 值环境下 中 间 产 物 B 不 稳 定 ， 分 解 形 成 次 卤 酸 （HOX； X=Cl-或 I-）， 最后由次卤酸作为卤化反应中真正的卤化剂。 具体 过程如图 1 所示， 只有酶反应底物能到达酶活性位点并 恰好与其结合， 才能按照酶催化反应的程序被卤化。 1.1.2 含有钒的卤代过氧化物酶 （vanadium containing haloperoxidases）
DOI:10.16167/j.cnki.1000-9868.2012.15.001
技术 Technique·食品工程
海洋放线菌卤代酶的研究进展
蔡宏明 张 建 王 硕 薛永常 （大连工业大学生物工程学院）
【摘要】 卤化物是含有卤素的二元化合物。 根据催化机理， 将卤代酶系统分为卤代过氧化物酶 （haloperoxidases） 和黄素依赖型卤代酶 （flavin-dependent halogenases）， 除这两大类之外， 还有甲基卤代转 移 酶 （methyl halide transferases） 和 氟 化 酶 （fluorinases） 等 。 本 文 综 述 了 这 几 类 卤 代 酶 的 特 点 ， 并 介 绍 了
目前， 病原微生物的耐药性越来越强， 致使药物的 效果越来越弱。 如何采用新技术和资源来筛选新的活性 次生代谢产物， 已是当今的亟待解决的问题。 海洋是一 个具有高盐、 高压、 低温、 低氧、 低光照和寡营养的特 殊环境。 在海洋环境下生长的放线菌具有与在陆地环境 下生长的放线菌不完全相同的生理特性。 从海洋放线菌 中提取的卤代酶， 可以使其作用产物发生卤代现象， 应 用于药物生产上可以得到更有效的药物。 研究海洋放线 菌中的卤代酶在药物制造和科学研究中具有重要意义。 本文就目前发现的主要卤代酶及反应机理和生物催化潜 力进行综述。
2 卤代酶的应用
2.1 在抗生素合成方面的应用 抗生素就是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生
物感染的药物。 越来越多的研究表明， 在许多抗生素的 生物合成基因簇中存在 FADH2 依赖型的卤代酶， 这些抗 生素包括 balhimycin、 藤黄绿脓菌 素和 rebeccamycin 等。 而且， 用化学合成来制备这类化合物非常昂贵， 而通过 直接操纵卤代酶基因为产生新的抗生素化合物提供了可 能。 Sanchez 等人在白色链霉菌中表达基因获得了新的杂 合抗生素， 证明了通过遗传操作获得新卤化物的可行性。 据统计目前约 20％的已上市的药物及 25％正在研发的药 物是卤化物。 2.2 在寻找新的化合物方面的应用
3 结语
对于卤化物的研究， 各国研究起步的都比较晚， 在 仅仅 30 年前大约只有 200 多种天然有机卤化物 被发现。 随着人们对新药研究热情的不断增加， 及由科学技术发 展带来的分离纯化技术的改进， 迄今为止已经从各种生 物中分离出 4 000 多 种 卤 化 物 ， 这 些 卤 化 物 的 来 源 包 括 细菌、 真菌、 动物和植物等， 其中大部分是由海洋生物 中提取和产生。 在这些卤化物之中， 绝大部分的卤化物 为氯化和溴化物， 氟化和碘化物很少， 只有极其少数化 合物既含氯也含碘。
1983 年 人 们 在 对 褐 藻 的 研 究 中 首 先 发 现 了 钒 的 成 分， 进而在对藻类、 苔藓和真菌中的研究中发现了含有 钒的卤过氧化物酶。 研究发现， 这种酶的活性依赖于钒 与其活性位点结合。 这种酶在 H2O2 存在时氧化卤素原子 （氯、 溴或碘） 产生自由酸作为卤化剂， 与含有血红素的 卤过氧化物酶相似。
在 对 丁 香 霉 素 E 和 抗 肿 瘤 活 性 物 质 barbamide 生物合成 研究时， 同位素标记研 究 显 示 前者的合成源于 Thr， 后者源于 Leu， 将二者的 生物合成基因簇和 FADH2 依赖型卤代酶基因相 比较并没有发现相似性。 根据某些卤代天然产 物生物合成基因簇的测序结果， 在推定的读码 框中并没有发现任 何卤代 过 氧 化 物 酶 或 FADH2 依赖型卤代酶的基因， 这暗示可能有新类型卤 代酶存在， 这类酶就 是非血 红 素 FeIIα-酮 戊 二 酸盐依赖型卤代酶。
Байду номын сангаас
这类酶具有底物特异性和很强的区域选择 性。 按底物的差异 性 ， FADH2 依 赖 型 卤 代 酶 可 以分为吲哚或色氨酸衍生物， 苯环或吡咯衍生 物两个亚类。 目前， 越来越多的研究表明在许 多抗生素的生物合成基因簇中存在 FADH2 依赖 型的卤代酶， 提示 FADH2 依赖型卤代酶是生物 卤化的主要机制。 1.3 非血红素 FeIIα-酮戊二酸盐依赖型卤代酶
近年来在卤代酶领域的发现和进展， 以期起到抛砖引玉的作用。
【关键词】 卤代酶； 放线菌； 海洋微生物； 卤化物 中图分类号： Q 93．33 文献标识码： A 文章编号： 1000-9868(2012)05-0122-03
卤化物包括氟化物、 氯化物、 溴化物、 碘化物以及 某些卤素互化物。 按组成卤化物元素的属性， 可以分为 金属卤化物和非金属卤化物。 自 1896 年从海洋菌株中分 离得到了第一个含卤素的天然化合物之后， 越来越多的 卤化物被发现。 迄今为止， 已经发现上千种的卤化物， 其中很多是重要的抗生素。
［ 3］ Van Pee K.H.. Microbial biosynthesis of halometabolites ［ J］ . Arch Microbiol， 2001， 175 （4）： 250-258.
［4］ Hemrika W.， Renirie R.， Dekker H.L.， et al. From phosphatases to vanadium peroxidases： a similar architecture of the active site ［J］ . Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94 （6）： 2145-2149.
过氧水解酶没有血红素辅基， 也不含任何金属离子， 由于其催化卤代反应的过程需要 H2O2， 因此这类酶曾经 归为卤过氧化物酶。 利 用 MCD 光 谱 分 析 法 ， van Pee 等 人从产卤化物的假单胞菌和链霉菌中分离到了这种酶。 结构研究表明， 这类酶 属于 α/β 水解酶， 生化研究表明 其活性依赖于短链羧酸。 1.2 FADH2 依赖型卤代酶 （FADH2 dependent halogenases）
1 卤代酶
根据催化机理， 将卤代酶系统分为卤代过氧化物酶 （haloperoxidases） 和黄素依赖型卤代酶 （flavin-dependent halogenases） ， 除 这 两 大 类 之 外 ， 还 有 甲 基 卤 代 转 移 酶 （methyl halide transferases） 和氟化酶 （fluorinases） 等。 1.1 卤代过氧化物酶
因为这个酶需要过氧化氢及卤素离子 （氯、 溴或碘） 来催化卤代反应， 所以被称为卤过氧化物酶。 该酶实际 上是由两个酶组成的， 其中一个是葡糖氧化酶， 另一个 是氯过氧化物酶。 由于卤过氧化物酶是胞外酶， 尽管在 体外卤过氧化物酶能催化其中间体的氯化， 却一直无法 证明卤过氧化物酶确实参与了 caldariomycin 的生物合成。
这种酶又被称为黄素依赖型卤代酶。 随着金霉素生 物合成基因簇的克隆及随后硝吡咯菌素生物合成途径被 阐明， 黄素依赖型卤代酶被发现。 该酶的核苷酸序列与 已知卤过氧化物酶、 过氧化物酶或过氧水解酶都没有相 似性。 研究表明这种黄素还原酶能从 FAD 和 NADH 产生 卤 代 酶 所 必 需 的 FADH2， 因 此 这 种 新 型 卤 代 酶 被 称 为 FADH 2 依赖型的卤代酶。
在 研 究 barbamide 生 物 合 成 途 径 时 ， Barbamide 基因簇中的 BarB1 /BarB2 与 syringomycin 基因簇中 SyrB 2 的氨基酸序列有很高的相似性， 这 类 蛋 白 属 于 一 类 非 血 红 素 Fe2+α-酮 戊 二 酸 依 赖 型 酶 ， 提示这类酶可能负责 syringomycin E 和 barbamide 合成中 的氯化， 但其催化机制尚未完全清楚。
该酶含有一个部分钒酸盐阴离子 H2VO4-， 一个羟基 位于其中轴线上， 过氧化氢攻击该羟基， 进而形成过氧
食品工程·Technique 技术
图 1 Cakdariomyces fumago 中的 含亚铁血红素氯代过氧化物酶推定的反应机理
化氢中间体， 该中间体迅速被质子化， 形成一个过氧复 合物-HVO2 （O2）， 然后卤离子和该复合物反应产生次卤 化钒酸盐。 形成的次卤酸作为真正的卤化剂导致了非酶 卤化作用， 同样导致了该卤代反应缺乏底物专一性和区 域选择性。 1.1.3 过氧水解酶 （perhydrolases）
参考文献
［1］ Berdy J.. Bioactive microbial metabolites ［J］ . The Journal of antibiotics （Tokyo）， 2005， 58 （1）： 1-26.
［2］ Hager L.P.， Morris D.R.， Brown F.S.， et al. Chloroperoxidase II utilization of halogen anions ［J］ . J Biol Chem， 1966， 241 （8）： 1769-1777.
FADH2 依赖型的卤代酶是许多抗生素生物合成基因 簇 中 的 后 修 饰 酶 。 Hornung 等 人 试 图 从 放 线 菌 中 发 现 新 的卤代酶基因， 进而发现新的抗生素合成基因簇。 试验
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结果表明， 在随机筛选的 500 株放线菌中约有 103 株 含 有潜在的FADH2 依赖型卤代酶基因。 这些研究表 明， 可 以通过寻找新的卤代酶来寻找新的含卤素抗生素。 2.3 在基因工程方面的应用
目前， 在基因工程方面， 根据卤代酶的核苷酸序列 片段设计引物， 并采用 PCR 的方法由海洋放线菌中扩增 筛选， 并进行测序鉴定， 最后使用分子生物学软件进行 分析。 研究发现海洋放线菌的阳性率远高于陆地来源的 放线菌， 可作为未来获得新卤化活性物质的一类重要微 生物资源。 而由基因方法获得的海洋放线菌中卤代酶基 因片段， 也为研究其在生物合成中的功能奠定了基础。
卤 代 过 氧 化 物 酶 首 次 被 发 现 是 在 Caldariomyces fumago 的细胞提取物里， 人们发现它可以将单氯双甲酮催 化为双氯双甲酮。 该反应可以不必确定底物而对酶活性
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进行研究， 并导致了更多卤代过氧化物酶的发现。 目前， 根据各种辅因子不同， 可以将卤代过氧化物酶分为三类： 1.1.1 含亚铁血红素的卤代过氧化物酶 （heme-containing haloperoxidases）
该酶在反应过程中被过氧化物氧化， 形成了一个中 间反应物 A， 由该中间反应物 A 对环境中的卤素离子进 行氧化作用， 形成了瞬时中间产物 B， 在低 pH 值环境下 中 间 产 物 B 不 稳 定 ， 分 解 形 成 次 卤 酸 （HOX； X=Cl-或 I-）， 最后由次卤酸作为卤化反应中真正的卤化剂。 具体 过程如图 1 所示， 只有酶反应底物能到达酶活性位点并 恰好与其结合， 才能按照酶催化反应的程序被卤化。 1.1.2 含有钒的卤代过氧化物酶 （vanadium containing haloperoxidases）
DOI:10.16167/j.cnki.1000-9868.2012.15.001
技术 Technique·食品工程
海洋放线菌卤代酶的研究进展
蔡宏明 张 建 王 硕 薛永常 （大连工业大学生物工程学院）
【摘要】 卤化物是含有卤素的二元化合物。 根据催化机理， 将卤代酶系统分为卤代过氧化物酶 （haloperoxidases） 和黄素依赖型卤代酶 （flavin-dependent halogenases）， 除这两大类之外， 还有甲基卤代转 移 酶 （methyl halide transferases） 和 氟 化 酶 （fluorinases） 等 。 本 文 综 述 了 这 几 类 卤 代 酶 的 特 点 ， 并 介 绍 了
目前， 病原微生物的耐药性越来越强， 致使药物的 效果越来越弱。 如何采用新技术和资源来筛选新的活性 次生代谢产物， 已是当今的亟待解决的问题。 海洋是一 个具有高盐、 高压、 低温、 低氧、 低光照和寡营养的特 殊环境。 在海洋环境下生长的放线菌具有与在陆地环境 下生长的放线菌不完全相同的生理特性。 从海洋放线菌 中提取的卤代酶， 可以使其作用产物发生卤代现象， 应 用于药物生产上可以得到更有效的药物。 研究海洋放线 菌中的卤代酶在药物制造和科学研究中具有重要意义。 本文就目前发现的主要卤代酶及反应机理和生物催化潜 力进行综述。
2 卤代酶的应用
2.1 在抗生素合成方面的应用 抗生素就是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生
物感染的药物。 越来越多的研究表明， 在许多抗生素的 生物合成基因簇中存在 FADH2 依赖型的卤代酶， 这些抗 生素包括 balhimycin、 藤黄绿脓菌 素和 rebeccamycin 等。 而且， 用化学合成来制备这类化合物非常昂贵， 而通过 直接操纵卤代酶基因为产生新的抗生素化合物提供了可 能。 Sanchez 等人在白色链霉菌中表达基因获得了新的杂 合抗生素， 证明了通过遗传操作获得新卤化物的可行性。 据统计目前约 20％的已上市的药物及 25％正在研发的药 物是卤化物。 2.2 在寻找新的化合物方面的应用
3 结语
对于卤化物的研究， 各国研究起步的都比较晚， 在 仅仅 30 年前大约只有 200 多种天然有机卤化物 被发现。 随着人们对新药研究热情的不断增加， 及由科学技术发 展带来的分离纯化技术的改进， 迄今为止已经从各种生 物中分离出 4 000 多 种 卤 化 物 ， 这 些 卤 化 物 的 来 源 包 括 细菌、 真菌、 动物和植物等， 其中大部分是由海洋生物 中提取和产生。 在这些卤化物之中， 绝大部分的卤化物 为氯化和溴化物， 氟化和碘化物很少， 只有极其少数化 合物既含氯也含碘。