血清药理学不是中药药理体外实验的适宜方法

血清药理学不是中药药理体外实验的适宜方法
张红敏1谢春光1陈世伟2*
（1成都中医药大学02级博士研究生，成都610075；2四川大学华西公共卫生学院营卫教研室在读博士，成都610041）
摘要：通过对血清药理学理论和应用的具体方法分析，认为该方法存在一些问题。

1、无确定的最佳给药方案；2、无法做到既保持培养体系内药物浓度与血药浓度相等又不影响组织、细胞生长；3、药效最佳的采血时间难以确定；4、含药血清灭不灭活，方法不统一；5、血清成分复杂，不可控的影响因素太多，实验结果重复性差；6、血清本身固有的活性成分影响试验结果，无去除血清影响的理想措施；7、血清药理学方法增加了分析药物成分的难度。

血清药理学不是中药药理体外实验的适宜方法，需客观对待。

关键词：血清药理学，方法学，中药代谢
Serum pharmacology not suiting for pharmacology research of the Traditional Chinese medicine in vitro Zhang hongmin1),Xie chunguang1),Chen shiwei2)
1)Chengtu university of Traditional Chinese Medicine,Chengtu6100752)Department of nutrition and food hygienic,West China college of public health,Sichuan university,Chengtu610041,China
Abstract:Realized some defects in serum pharmacology by analyzing its theory and specific methods.There are seven main problems that existed in the serum pharmacology.As follows:1No best definitive method of administration.2No way to maintain the drug concentration in the medium equaled to it in blood and not to affect the growth of the tissues or cells cultured.3Hard to determine the best time getting the drug serum had the highest effects.4Serum,contained drugs,inactivated or not was not coincidence.5Complicated serum component and too many affecting facts resulted that the same experiment had different results.6Active substance in serum itself affects experiment results.7Serum pharmacology increased the difficulties analyzing herb chemistry component.Therefore serum pharmacology was not suitable for pharmacology research of the Traditional Chinese medicine in vitro.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：serum pharmacology,methodology,the Traditional Chinese medicine metabolism 1988年田代真一正式提出了血清药理学这一概念[1]。

血清药理学是指动物经口服给药后，采集动物的含药血清进行体外试验的一种实验方法[2]。

国内到90年代初才开始探索，国家非常重视并给予扶持。

1991年国家中医药管理局正式立题，1996年国家自然科学基金将其列为重点项目，使该方法得到比较系统的研究。

此后，血清药理学方法被广泛地应用于中药的药理学研究中[3]。

目前认为，该方法适合在细胞、亚细胞、分子水平对中药及中药复方进行深入的机制研究[4、5]；是针对中药及其复方成分复杂多样的特点而设，其可信度、科学性、可行性都较以往应用中药粗制剂直接体外给药进行中药药理研究具有一定的优势[1、6-9]，既能防止中药粗制剂本身理化性质对体外实验的干扰，又能反映中药在胃肠道消化吸收，再经生物转化，最后产生药理效应的过程，代表了药物在体内产生作用的真正有效成分；不仅反映了药物中可吸收部分的直接作用，而且能反映药物成分在机体作用下形成的代谢产物和药物诱导产生的机体内源性物质的间接效果[7]。

但是笔者认为，血清药理学方法不是中药及中药复方进行离体试验的适宜研究方法。

因为该方法不论在方法学方面，还是自身理论方面都存在着难以避免、无法克服的问题。

下面就该方法存在的问题做一具体论述。

1无确定的最佳给药方案
在进行血清药理学实验时，为获得血药浓度达到药物发挥最大效应的最佳浓度，确定合适的给药方案非常重要。

虽相关研究不少[10-14]，但目前尙无统一的方案可供选择。

有文献推荐[14]：给药方案要根据药物的半衰期（T1/2）、达峰时间（T max）等药动学指标确定，最好是每隔1个半衰期给药1次，连续给药4～作者简介：张红敏（1969-），女，主治医师，主要从事内分泌与肾脏疾病的防治研究。

*通信作者：陈世伟，成都市人民南路17号，邮编610041。

E-mail：csw3000@
6次，即可达到最大血药浓度。

但是中药及中药复方成分复杂，药效成分不明，监测何种成分的T1/2、T max 呢？如果药效成分明了，那还有应用血清药理学方法的必要吗？
2无法做到体外培养体系内药物浓度与血药浓度相等又不影响组织、细胞生长
含药血清加入体外反应系统后，血药浓度被稀释，可能出现假阴性结果。

使体外反应系统中具有与在体条件下可比拟的药浓度，是血清药理实验方法需要解决的问题[13]。

常采用的解决方法如下。

2.1增加给药剂量。

具体的给药剂量如何计算？王力倩等[15]提出用参考公式计算给药剂量，制备含药血清，具有一定的合理可行性。

给药剂量等于临床用量乘以动物等效面积系数（按体表面积）再乘以培养基内血清稀释度。

但此法存在的问题[16]是:首先血药浓度并不能与给药剂量呈等倍提高，给药剂量加倍，血药浓度不一定加倍；再者给药剂量可以提高的倍数受到灌胃药物浓度和体积的限制，不一定能达到公式所要求的量。

因此，通过增加给药剂量达到含药血清中药物浓度与血药浓度相等基本是不可能的。

2.2不增加给药剂量而增加血清添加量[17]。

吴健宇等认为适当地增加血清添加量是可以的，如果选择种属较接近的动物血清，甚至可以加到100%的浓度，即在纯血清内培养。

但同时吴健宇等也认为并不是所有的培养系中均可添加高浓度的血清，必须考虑实验体系中被培养细胞的血清最大耐受性。

一般认为含药血清浓度不宜过高，超过某种限度，将对细胞或组织活动产生不利影响[7、13、18]。

以不超过20%为宜[7]。

也就是说，在保证组织、细胞生长良好的前提下，不能保证实验体系内药物浓度与与血药浓度相等。

2.3采用血清冻干粉[13]李仪奎提出在制备得到含药血清后，先在冰箱中冻成固体冰块，然后在-70℃条件下，真空干燥蒸干水分，形成干燥粉末。

以冻干粉加入反应系统，使之达到需要的浓度。

即以相当于100Ｌ的含药血清冻干粉加入100Ｌ培养液中。

虽采用血清冻干粉法可以达到保持培养基内药物浓度与血药浓度相等的要求，但从血清冻干粉的制备过程可知，血清冻干粉较纯血清损失的只是水分，血清的固形成分并未除去。

在培养体系中加入血清冻干粉等于添加100%的含药血清。

这与他本人含药血清的加入量都有一定的限度，超过这一限度，将对细胞或组织活动产生不利影响的观点[13]自相矛盾。

目前尙没有更好的方法既能使组织、细胞生长良好，又使被测药物的浓度与血药浓度相等，以避免假阴性结果出现。

3药效最佳的采血时间难以确定
动物给药后，应在什么时间采血制备含药血清？理想的采血时间应落在血药浓度的高峰。

这样可以避免由于药效物质被代谢减少殆尽或尚未吸收造成的假阴性结果[19]。

如何达到这一目的？目前没有一个成熟的方法可供参考[13]。

对该问题研究较多，结论不一，几乎无规律可循。

有报道川芎煎剂或川芎伍用丹参等给大鼠灌胃后，其主要有效成分之一川芎嗪的血药浓度达峰时间在30min前[20]。

正常人口服川芎单煎汤剂后，体内阿魏酸达峰时间也在30min前[21]。

周明眉等[22]进行的中药血清药理学的方法学研究认为，给药30min后所采含药血清抑制血小板释放5-HT及阻滞内皮细胞钙通道作用较给药60min、120min、180min和360min后采血所得血清强。

但给药30min后采血所得血清中，复方药效成分含量是否为给药后整个药物代谢过程中的峰值，并不能得到结论。

有学者[23]认为同一方剂的不同药理观察指标，其达峰时间也不一定相同。

究其原因，不同中药、不同组方，对不同疾病、不同证型，药效成分可能不同，所以其血药浓度达峰时间也就不同。

难怪目前中药血清药理学实验中常用的采血时间为60min、90min、120min等。

这使得对于一个具体复方（药效成分不明）采用血清药理学方法做药效试验时，无所适从：不知道何时采血药效最佳。

4含药血清灭不灭活，方法不统一
4.1灭活采取此种方式者较多[11、15、24－30]。

理由是：血清中原有许多酶、抗体、补体、细胞因子及其它生物活性物质可能对体外培养的组织器官、细胞、病毒、病原菌等产生直接影响而干扰实验结果，影响药物疗效的客观评价。

血清灭活后有助于减少血清的非药理性干扰，也符合减少微生物污染的常规细胞培养要求[31]。

4.2不灭活含药血清不经灭活处理，直接用于试验[19、32、33]。

理由是：药物血清灭活后，血清中含有的机体在药物作用下产生的内生性有效成分（如补体）将减少或丧失，必然影响药理实验结果。

再者与体内实验和临床用药情况也不相符。

至于血清的非药理性干扰，可以设空白对照组来加以衡定和排除。

事实上，
56℃、30min对绝大多数微生物根本没有杀灭作用[34]，起不到减少污染的作用。

4.3灭活与否对实验结果影响不大周明眉等[35]在进行含药血清抑制血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙离子通道两项实验研究时，发现血清在灭活过程中所除去的生物活性物质对实验结果影响不大，灭活与否对实验结果影不影响与实验所选指标有很大关系。

含药血清灭不灭活关键问题是：不灭活难以排除血清中原有生物活性物质的干扰；灭活则可能将药物诱生的活性成分除掉。

如何既能将血清中原有生物活性物质除去又保留药物诱生的活性成分？不论灭活与否，都不能两全其美。

从这里也可以看出，血清药理学方法肯定存在问题。

5血清成分复杂，不可控的影响因素太多，实验结果重复性差
虽现在已基本达成共识，含药血清的供体动物必须与体外试验离体组织、细胞的供体动物具有同质性。

这种同质性除了表现在种属、年龄、性别、体重等方面外，供体动物应该造模，即应处于相同的生理病理状态[36]。

但即使这样，由于血清成分非常复杂，不可控的影响因素太多，它不是人为的单一的可完全控制的实验对象。

实验环境的无法完全统一[14]，导致了实验结果的重复性差，实验结果成了发表论文的游戏素材[37]。

6血清本身固有的活性成分影响试验结果，无去除血清影响的理想措施
对于既定的药效指标，进入血液中的中药化学成分相对于血清中原有内源性活性物质产生的影响，绝大多数情况下是微乎其微的[37]。

所以用含药血清后，血清非药物影响的、本身固有的多种生物活性物质可能会影响体外实验模型的建立[16、38]，影响离体细胞的生物活性[39]，最终影响试验结果，甚至导致假阳性或假阴性结果[14]。

这点可以从空白血清就出现显著的阳性反应得到证实。

例如：在观察小青龙汤对离体豚鼠气管平滑肌的作用时，发现空白血清对组胺致豚鼠平滑肌痉挛有明显的解痉作用，甚至超过待测药物的强度[40]。

坤血安为经典产后方生化汤的优选方，离体小鼠子宫实验证明具有良好的兴奋子宫作用，按通常的56℃加热灭活方法处理过的空白血清对离体子宫同样具有很强的兴奋作用[41]。

血清药理学对此常采取以下不成熟的措施，以求去除血清本身对实验结果的影响。

措施一：采用空白血清对照[13、16]。

对于某一药效指标而言，空白血清和含药血清的作用不是无和有的关系。

因此即使采用严格的空白血清对照，也难以正确评判、分析试验结果。

措施二：预处理血清。

除设立严格的对照外，将血清进行预处理，来减少空白血清的干扰。

但预处理血清仍可能出现一些问题：①被去除的固体物质中包括药物所含属于药物有效成分的多糖和氨基酸等。

②同时也去除了药物进入机体后诱生的蛋白类活性物质。

③许多药物成分可能同血浆蛋白有较高的结合率，处理后的血清，药物的结合部分也被除去。

由于存在以上问题，提出血清预处理方法的研究者也指出预处理血清不能作为常规[13]。

既然血清本身固有活性物质对试验结果的影响无法去除，也就无法证明应用血清药理学方法作出的药效试验结果是中药或其代谢产物的作用而不是血清成分的作用。

这与血清药理学方法代表药物在体内产生的真正作用的初衷相违背。

7血清药理学方法增加了分析药物成分的难度
中药及中药复方成分本来就非常复杂。

有报道：对于复方提取物，几乎包含各类化合物――离子性、强极性、中等极性、弱极性、对映体、挥发油类、大分子、金属离子和微量元素等[23]。

用含药血清后，又增添了血清成分，血清学自身复杂的组分至今尚未完全清楚。

两个未知体系的叠加，使原本已经很复杂的体系就更加复杂[42]。

中药复方药效物质基础是中药复方现代化研究的核心，是目前中药基础研究中应重点突破的关键问题[23]。

中药复方的疗效到底是由进入体内的何种或哪些化学成分所引起的？是中医药走向世界四大障碍的关键和基础[23]。

现代分析技术虽然已有长足的发展，但要分离、鉴定血清中的中药化学成分，进而找到若干活性成分也还是有一定的难度[37]。

就目前的技术手段，人们尚不具备这方面的能力[45]。

不得不承认，血清药理学方法增加了分析药物成分的难度。

血清药理学经过近二十年的发展，在方法学方面虽做了诸多改进，但通过对血清药理学方法存在问题的分析，不难发现：运用血清药理学方法进行试验时，各步骤都存在太多的不确定因素，存在或然的、甚至截然不同的方法。

在没有共同规律可寻的情况下，最好做预试验成了最好的托词。

然而，预试验的
评判标准又是什么呢？自己根据具体试验确定的标准怎么能有说服力呢？因此采用血清药理学方法所得的药效实验结果常常受到质疑[36]。

目前有学者提出，血清药理学方法不是一种成熟的方法[39]。

血清药理学方法自问世以来，受到了广泛关注和高度评价。

毋庸置疑，该方法是中药药理学研究方法和思维的新突破[3]。

但是，我们应该清楚地看到该方法存在的无法克服的问题和局限性。

不少学者强调指出，关于中药复方研究，应该把方法学研究当做研究的中心[43]。

中药现代化的发展期待着新研究方法的创立[44]。

我们应拓宽思路，寻找能更真实地模拟中药及中药复方体内代谢的方法，来制备体外实验的中药及其代谢物。

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