第二章 功能标记开发与定位

3 产物检测及图谱分析
• 4%变性聚 丙烯酰胺 凝胶电泳
4 特点
• • • • • 共显性标记系统 多态性强 DNA需要量少 简单且花费少 标记分布均匀
• 缺点：若未利用扩增区域序列的任何信息，则 产生的标记是随机分布的，严格地说，不是功 能标记。若针对某一特定基因设计SRAP引物， 则标记为功能标记。
第二节 功能标记开发
• 原理：基于已知功能基因序列变异区设 计引物进行特异扩增，扩增产物唯一或 者能容易与其他基因区分。
• 一个基因结构中，变异较大的是内含子 区， 5’UTR，3’UTR，外显子比较保守。
EXON
INTRON
ORF (open reading frame)
CDS (coding sequence)
3 产物检测及图谱分析
• 6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.2.4 PCR-DGGE标记
• 基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳标记。
• 原理：根据功能基因结构域基序单核苷酸多态 性设计引物进行特异扩增，然后将扩增产物进 行变性梯度凝胶电泳分析。
PCR 程序
• 巢式或半巢式PCR：touch dowd • 94 ℃变性4 min ; • 退火20 个循环(94 ℃ 1 min , 65～56 ℃ 1 min ,72 ℃ 1 min , 2 个循环降1 ℃); • 延伸10 个循环(94 ℃1 min ,55 ℃ 1 min ,72 ℃1 min); • 续延伸，72 ℃ 6 min.
STS 功能标记开发
• • • • • 1 2 3 4 5 获得某一已知功能的基因序列 同源序列或等位基因比较获得变异区序列 针对变异区设计引物 特异扩增 图谱分析，差异条带寻找
• UniGene 数据库 （ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ ）
建立特定染色体的基因组文库
5’ TGAGTCCAAACCGGAGC 5’ GACTGCGTACGAATTTGC 3’ 3’
5’ TGAGTCCAAACCGGAAT 3’ 5’ TGAGTCCAAACCGGACC 3’ 5’ GACTGCGTACGAATTGAC 3’ 5’ GACTGCGTACGAATTTGA 3’
2 反应体系及条件
正向引物
外显子
内含子
反向引物
外显子
内含子
1.2.2 SRAP标记程序
• 1 引物设计 • 上游引物长17 bp, 对外显子进行特异扩增； 下游引物长18 bp，对内含子区域、启动子区 域进行特异扩增。
上游引物
5’ TGAGTCCAAACCGGATA 3’
下游引物
5’ GACTGCGTACGAATTAAT 3’
习 题
• 1 • 2 • 3 • 4 什么是功能标记？ 功能标记有什么特点，分为哪些类别？ 如何开发一个功能标记？ 如何将功能标记定位到染色体上？
2D染色体上PPO基因STS功能标记
713bp 490bp
PPO29与PPO16是一对互补标记，即，用PPO29扩增，高活性品种 均能扩出490bp条带，低活性品种扩不出条带；用PPO16扩增，低 活性品种均能扩出713bp条带，高活性品种扩不出条带。
第三节 功能标记定位
3.1 非整倍体定位技术
SSCP-SNP
插 入 检测 缺 失 区
微 检测卫 星 区
SSCP-SNP
simple sequence repeat–functional domain marker (SSR-FDM)
与水稻籽粒长度高度相关的GS3基因第二 外显子单个SNP（C–A）功能标记
• 水稻GS3基因第二exon 单个核苷酸由C突变成 A导致籽粒增长。
• 即用功能标记的特异引物对相应非整倍 体物种基因组进行扩增分析，若哪一条 染色体或染色体臂未被扩增出目标条带， 则标记被定位在该染色体或染色体臂上。
3.2 连锁标记技术
• 即，寻找与功能标记紧密连锁的分子标记， 计算重组率，将功能标记定位在连锁图谱上。 一般所用分子标记是SSR标记。
3.3 FISH技术
1 引物设计
• TRAP技术采用两个18 核甘酸引物 产生标记, 一个为固定引物, 依据EST 序 列设计; 另一个为随机引物, 针对外显子 和内含子的特点, 设计为分别富含GC 或 AT 核心区的任意序列。
正向引物
外显子
内含子
反向引物
外显子
内来自百度文库子
2 反应体系及条件
• 反应体系：20L • 40 ng DNA 模板, 引物各0.25 mol/L, dNTPs 200 mol/L, 1× PCR buffer, 15 mmol/L MgCl2, 1 U 的Taq 酶, 不足部分由ddH2O补足。 • 反应条件： • 94℃变性5 min, 1 个循环; 94℃变性1 min, 35℃复性1 min, 72℃延伸 1 min, 5 个循环; 94℃变性1 min, 50℃复性 1 min., 72℃延伸1.5 min,35 个循环; 72℃延伸 5 min
• 反应体系：20L • 30 ng DNA 模板, 引物各0.3 mol/L, dNTPs 200 mol/L, 1× PCR buffer, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 U 的Taq 酶, 不足部分由ddH2O补足。
• 反应条件： • 94℃变性5 min, 1 个循环; 94℃变性1 min, 35℃复性1 min, 72℃延伸 1 min, 5 个循环; 94℃变性1 min, 50℃复性 1 min., 72℃延伸1.5 min,35 个循环; 72℃延伸 5 min
第二章 功能标记开发与定位
第一节 功能标记的概念与种类 第二节 功能标记开发 第三节 功能标记定位
第一节 功能标记的概念与种类
• DNA标记 多态性分 子基础示 意图
分子标记在染色体上的分布
内含子
外显子
重复区域 5’UTR 3’UTR
基因 代表标记
1.1 功能标记的概念
• 又称诊断标记，是基于生物功能已知的引起 表型变异的基因内部序列多态性位点开发的分 子标记。前提是目标基因的生物学功能已经明 确。 重复序列 连锁标记 功能标记 功能已知 基因 功能未知 基因标记
分 子 标 记
性状
同源基因
1.2 功能标记的种类
• 1.2.1 SRAP标记 • Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列扩 增多态性。 • 原理：利用独特的引物设计对ORFs 进行扩增， 上游引 物长17 bp, 对外显子进行特异扩增； 下游引物长18 bp， 对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。 因个体不 同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多 态性。
如
何
找
随机选择克隆进行短片段单次测序
到
一 个 S T S
比对确认不含重复序列
在序列上寻找引物
合成引物对基因组DNA进行PCR
产物为单一片段即是STS标记，确 认其在染色体上的位置
举例：PPO基因STS功能标记开发
2A染色体上PPO基因STS标记的分子基础
2A染色体上PPO基因STS功能标记
2D染色体上PPO基因STS标记的分子基础
图谱分析
• 针对16s rDNA结果
葡萄糖262磷酸脱氢酶( G6PD)
急性白血病胸苷酸合成酶( TS)
1.2.5 其它功能标记
• • • • 针对内含子扩增的： IFLP：内含子片段长度多态性 ISAP：内含子序列扩增多态性 SSCP-SNP：基于SNP的单链核苷酸构象多态性
• 针对启动子扩增的： • PRAP：启动子区域扩增多态性 • 针对外显子扩增的： • STS：序列标签位点 • RGA：抗病基因类似序列
1.2.3 TRAP标记
• Target Region Amplified Polymorphism，目标 区域扩增多态性，或靶位区域扩增多态性。 • 原理：是利用生物信息工具和EST 数据库信 息, 产生目标候选基因区多态性标记。TRAP 技术采用两个18 核甘酸引物产生标记, 一个 为固定引物, 依据EST 序列设计; 另一个为随 机引物, 针对外显子和内含子的特点, 设计为 分别富含GC 或AT 核心区的任意序列。
• 即，用功能标记扩增得到的序列作探针， 与基因组染色体进行荧光原位杂交，有 杂交信号的染色体即是定位到的染色体。
3.4 电子定位技术
• 利用生物信息学和公用生物数据库工具 进行查询、分析功能标记的染色体图谱 位置。 • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/e-pcr/