氧化应激的定量评价方法大致分做三类

氧化应激的定量评价方法大致分做三类：1）测定由活性氧修饰的化合物；2）测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量；3）测定含有转录因子的氧化应激指示物。而根据氧化应激的物质种类，又可主要分为蛋白质氧化损伤标志物检测、脂质过氧化标志物检测、核酸DNA/RNA损伤检测以及活性氧消除系统酶和抗氧化物质检测等。

检测的方法也是多种多样，化学法、免疫染色、ELISA等等

就本人经验，核酸DNA/RNA损伤，如8-OHDG ELISA 等方法是比较可靠的，但是通常损伤较重才可能检测出，而传统MDA等脂质过氧化标志物、各种氧化酶化学检测是比较简便的，但却稳定性很差。

大家能否谈谈自己曾采用的相关方法，并从敏感性、简便性等方面谈谈自己的方法

ROS氧化损伤碱基后，碱基不稳定，自己掉下去，可以形成AP site(apurinic/apyrimidinic site or abasic site)，或者损伤的碱基被碱基切除（base excision repair）机制切掉形成中间产物。AP site一般不直接引起细胞凋亡，但是当量太大而又处在S期DNA复制时，细胞在修复AP site 时形成nick直接激活PARP，或者两条互补链上临近的APsite会导致双链断裂，这样激活ATM等，就会进一步传递信号触发细胞凋亡机制了。一般活性氧才会损伤DNA，过氧化氢不会

氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素

细胞氧化损伤后需证实细胞功能障碍可检测哪些指标啊?

1.细胞存活率的测定

在细胞氧化损伤过程中,每隔半小时吸取100μL细胞液置于96孔微量滴定板,存活细胞用MTT(噻唑兰,serva)染色法确定.MTT溶于pH7.2PBS(终浓度5g/L),过滤灭菌.每孔加入20μLMTT溶液,37℃孵育4h,每孔再加入100μL酸性异丙醇(100μL异丙醇中含

0.04NHCl),混匀,静置5min后,将96孔滴定板置于酶联免疫检测仪上,于波长570nm处

测定每孔光吸收值OD,用不加MTT的细胞孔作本底对照,细胞存活率=([OD]t/[OD]u)×100%,此处[OD]t为经3种处理方式处理过的细胞光吸收值,[OD]u为未经任何处理的细胞的光吸收值.

2. 凋亡细胞DNA电泳分析

以800g的速度离心收集处理过的细胞,弃上清后悬浮于40μL96%0.2M磷酸氢二钠于4%0.1M柠檬酸的PC缓冲液中(pH7.8)30min;1kg离心5min后将上清转移至0.5mL Eppendorf管,真空浓缩20min;加入3μL0.25%NP-40溶液和3μL RNaseA(1g/L)溶液,在37℃下孵育30min后,再加入3μL 1g/L蛋白酶K,37℃下继续孵育30min,最后加入12μL电泳指示剂溶液(含0.25%溴酚兰,40%蔗糖).将样品小心加入含溴乙啶的0.8%琼脂糖凝胶点样孔中,在25V电压下电泳10h,于紫外透射仪上观察电泳结果并拍照保存

氧化损伤是引起许多组织细胞凋亡的一个重要机制。在一些因素的诱导下，容易发生氧化应激反应。而氧化和抗氧化作用失衡所致氧化应激引起胰岛R细胞损伤是糖尿病发生、发展的一个重要机制。近年来许多实验研究表明，高糖环境、细胞因子、胰岛淀粉样多肤(LAPP)等可引起体内某些细胞发生氧化应激反应，细胞损伤。

多种代谢紊乱导致人体内环境的改变，氧自由基产生过多，而自身的抗氧化防御系统受损害，导致机体处于氧化应激状态。红细胞内所含有的超氧化物歧化酶(SOD)及谷光甘肤过氧化物酶(GSH一PX)是高效的自由基清除剂，能保护细胞膜免受氧自由基的损伤，体内SOD减少，可加重氧化应激。而自由基形成的增加导致脂质过氧化的加速使脂质过氧化物(LPO)产生增多。通过给予抗氧化剂VitE, VitC后氧化应激改善。

自由基可以直接作用于核酸，引起基的修饰碱和DNA 链的断裂。碱基的改变可导致在基因控制下进行的许多生物过程受到破坏；DNA链断裂可使核酸的完整性和构型受到破坏，最终引起细胞死亡。修饰过的DNA，一方面具有抗原性，刺激机体产生抗体，导致机体自身免疫反应发生。另一方面，DNA携带有遗传信息，自由基作用于DNA 导致遗传信息的改变，从而控制以DNA 为模板的蛋白质的合成，参与机体代谢。由于生物体系的复杂多样性，DNA氧化损伤的研究主要集中在体外模型系统上。自由基引致DNA 损伤主要表现为碱基释放、解聚、碱基受损、交联. 种类型。在脂质体、红细胞膜、大鼠肝细胞核膜脂质过氧化对核DNA 影响的研究中，发现脂质过氧化引起的DNA 损伤以交联为主。利用原子力显微镜能够直接观察到交联DNA 的生力显微镜能够直接观察到交联DNA 的生成。脂质过氧化过程中会产生多种活性氧自由基。而活性氧自由基的诱变作用已有报道。有研究证实，组织细胞内脂质过氧化作用的增强导致活性氧的产生量增加，引起基因突变和线粒体DNA的氧化损伤

8-羟基脱氧鸟苷，是反映遗传物质DNA氧化损伤的一个重要指标

1、2，4．二硝基苯肼(DNPH)比色法是测定蛋白质羰基含量的经典方法。蛋白质的羰基化被广泛地用于评价各种生物有机体的氧化程度，蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标.

2、蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统(MCO系统)完成的。在这个过程中，Fe 和cu。可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。被H 0 或0 攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰基化。此外，羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。

3、DNPH法的工作原理：被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4-

二硝基苯肼反应生成2，4．二硝基苯腙，2，4．二硝基苯腙为红棕色的沉淀，可在分光光度计上读取370 nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。

4、盐酸胍的作用：溶解沉淀2，4．二硝基苯腙