57-解脲脲原体(UU)核酸定量检测标准操作规程(荧光PCR法)

解脲脲原体（UU）核酸定量检测标准操作规程
（荧光PCR法）
1.目的
规范解脲脲原体（UU）核酸DNA定量（PCR－荧光探针法）检测操作流程，准确进行解脲脲原体（UU）DNA定量分析。

2.应用范围
使用泰普生物科学(中国)有限公司解脲脲原体（UU）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行解脲脲原体（UU）DNA 检测。

3.职责
由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。

4.内容
4.1 实验原理及其临床应用
采用聚合酶链式反应(PCR)及荧光标记探针技术，快速检测临床样品中解脲脲原体特有序列，从而判断解脲脲原体的存在。

适用于对生殖道、尿道分泌物拭子样本中的解脲脲原体（UU）核酸进行体外定性检测，可用于解脲脲原体感染的辅助诊断及疗效监控。

4.2标本采集
4.2.1使用标本类型：生殖泌尿道分泌物等。

4.2.2标本采集
4.2.2.1 生殖泌尿道分泌物
4.2.2.1.1 男性：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。

4.2.2.1.2 女性生殖道：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检。

4.2.2.1.3 女性尿道：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检。

4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。

标本运送时应采用0℃冰壶。

4.3试剂准备
4.3.1供应商：泰普生物科学(中国)有限公司
4.3.2此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回
冰
箱-20℃。

4.3.3如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。

4.4标准品和质控品
4.4.1标准品、质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。

4.4.2标准品、质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。

4.4.3标准曲线和质控频度：每次实验均需做标准曲线和质控。

4.5 操作过程说明
4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理：分别取出UU阴性、弱阳性、阳性质控品，8,000 rpm离心数秒，各吸50ul至1.5灭菌离心管中，加入50ul DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟。

将处理好的质控品转至4℃静置10min,10000rpm离心5min,4℃保存备用。

4.5.1.2 生殖泌尿道分泌物棉拭子
4.5.1.2.1 向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子。

4.5.1.2.2 吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，10,000 rpm离心5分钟。

4.5.1.2.3 去上清，向沉淀中加灭菌生理盐水1ml，混匀，10,000 rpm离心5分钟。

4.5.1.2.4 去上清，向沉淀中加入50ul DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟，将处理好的样本转至4℃静置10min,10000rpm离心5min,4℃保存备用。

4.5.2 加样: 从4℃冰箱取出处理好的样本、质控品和标准品转移至加样区，取上清液5ul 加至PCR反应管进行PCR扩增。

4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.3.1 打开计算机电源。

4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。

打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。

如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。

4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。

4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。

(绿色)则说明卤钨灯已经打开；（黄色）则说明卤钨灯正在预热；（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。

在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿色）。

4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。

4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard （标准品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。

对于标准品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。

方法为：点击，10倍的浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。

也可以直接点击标准品的各个孔位，在一栏，手工输入浓度。

若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。

或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。

4.5.3.7 点击，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间改变各项温度、时间、循环数等。

在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击
，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。

要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。

如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。

点击，导入以前设定的PCR程序。

（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。

可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。

若要去除，可将其拖出循环设定区域。

4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。

会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。

软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。

在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。

还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。

4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。

4.5.3.10 PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，也可点击手动进行结果分析。

可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。

点击
可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。

左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。

右边的
可根据自己的需要选择显示的界面。

是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。

4.5.3.11分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing 对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，
如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。

4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。

4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。

点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis （多项实验结果分析）选项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common threshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。

4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。

在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。

4.5.3.7.5 分析质控结果
阴性质控品：UU(FAM)Ct值= 40或“No Ct”，内参照（HEX）Ct值﹤40,且有较好的对数增长曲线。

阳性质控品：UU(FAM)有较好的对数增长曲线。

18≤Ct值≤24。

弱阳性质控品：UU(FAM)有较好的对数增长曲线。

27≤Ct值≤33。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。

4.5.3.8 记录实验数据。

4.5.3.9 关闭扩增仪电源和计算机电源。

4.5.4
Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。

4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。

4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。

4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置界面：。

4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。

4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。

4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。

4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。

4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集荧光。

4.5.4.10 在“”菜单栏下，通过“”增加或者减少实验项目类型，通过右边的孔位选择，设置不同项目的区域，然后点击“Apply”保存。

4.5.4.11 在“”菜单栏下，Step 1处，选择“Abs Quant”；Step 2处，编辑标准品及样本。

4.5.4.12 标准品设置：在Step 2下的96孔面板中，选中标准品反应孔，然后选择右侧的模板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位的“Quantification Sample Type”选择为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。

4.5.4.13 样本设置：类似于标准品设置，但仅需要编辑其“Sample Name”即可。

4.5.4.14 返回“”菜单，在“”子菜单右下角点击
“”，运行实验。

4.5.4.15 实验结束后，在“”菜单下，选择“Abs Quant/Fit Points”，进入结果分析界面：
【Analysis】：在此菜单下对阈值线进行调整；
【Noise Band】：对实验的信噪比进行调整；
【Filter Comb】：对不同荧光通道进行选择；
【Std Curve】：对定量参考品进行选择，包括实验中的参考品、导入的标准品等；
4.5.4.16 在上述操作完成后，点击“”；在“”菜单中，根据需要选择报告中需包含的项目，然后得出结果。

4.5.4.13.4 分析质控品结果：
阴性质控品：UU(FAM)Ct值= 40或“No Ct”，内参照（HEX）Ct值﹤40,且有较好的对数增长曲线。

阳性质控品：UU(FAM)有较好的对数增长曲线。

18≤Ct值≤24。

弱阳性质控品：UU(FAM)有较好的对数增长曲线。

27≤Ct值≤33。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。

4.5.4.16 记录实验数据。

4.5.4.17 关闭扩增仪电源和计算机电源。

4.6 检测性能评价：线性范围
5.0×102～5.0×108基因拷贝
4.7 检测下限：
5.0×102基因拷贝
4.8 参考值：＜
5.0×102基因拷贝
4.9 异常结果报告方式及处理流程
4.9.1弱阳性结果，如：
5.0×102基因拷贝，应结合曲线判断，如果不能判定则需要重新检测。

4.9.2 强阳性结果，如：>
5.0×108基因拷贝，应结合曲线判断并稀释样本重新进行检测，然后再结合实际情况发报告。

如果在实验中出现了以上情况，首先应该向科室负责人进行汇报，并进行复查检测，如果结果仍然是异常，需上报科室负责人，经得同意，才能将报告发出。

4.10 方法局限性和注意事项
4.10.1 PCR荧光定量检测法比较容易受污染，所以实验过程中应尽量避免反复开盖，所用耗材均需高压灭菌。

4.10.2 PCR荧光定量检测法不同于生化定量检测法，所以每次重复实验后结果不一定吻合，波动范围一般在1.0×101基因拷贝/ml是可以接受的。

4.10.3 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。

4.10.4 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。

如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。

4.10.5 实验完毕应用有效氯终浓度为2000mg/L的消毒液擦拭桌面，并打开紫外线灯消毒。

本作业指导书颁发部门: 质管部
本作业指导书分发部门：PCR室
本作业指导书编写人: 编写日期：年月日本作业指导书审核人：审核日期：年月日本作业指导书审批人: 执行日期：年月日。