小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨

小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨

卵泡是卵巢内的基本功能单位，包含一个卵母细胞、颗粒细胞及膜细胞〔1〕。卵泡膜间质细胞( theca －interstitial cells，TIC) 是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的间质细胞，它在卵泡的生长发育、闭锁过程中发挥着多种重要作用〔2 －4〕，同时作为卵巢微环境的主体成分之一，TIC 参与了卵巢衰老〔5〕及多囊卵巢综合征等卵巢相关疾病〔6〕的

发生发展。为了能够进一步深入研究TIC 对卵巢功能的影响及其作用机制，在体外构建一个可最大程度模拟体内环境下卵泡与TIC 相互关系的共培养模型是十分有意义的。目前卵

泡的培养主要包括二维法和三维法，而共培养方法包括直接接触式和非直接接触式。本研究拟采用海藻酸钠凝胶( alginate hydrogel，ALG) 和Transwell 构建3种共培养模型，从卵

泡的形态观察、生长发育、存活率、激素分泌水平和减数分裂恢复情况等方面进行综合评价，旨在探索一种最佳的共培养方法。

1 材料和方法

1. 1 实验动物由武汉大学动物实验中心提供SPF级C57BL/6 小鼠，动物处理过程遵守动物保护与使用原则，并获华中科技大学同济医学院动物保护委员会批准。

1. 2 主要试剂Lebovitz＇s L －15 培养基( Invitrogen) 、－MEM 培养基( Hyclone) 、注射用重组人促卵泡激素( Merck serono) 、FBS( Gibco) 及hCG( 赤峰博恩药业有限公司) ，其他试剂均购自sigma 公司。

1. 3 卵泡膜间质细胞的分离与培养分离21 ～25 日龄C57BL/6 雌鼠的卵巢，针刺

以尽量多地释放出卵泡中的颗粒细胞。将残余组织充分剪碎后用消化液( McCoy＇s 5a 培养基+4 mg/ml 胶原酶Ⅳ+10%胎牛血清) 37℃消化 1 h，每15 min 吹打 1 次。将消化好的细胞悬液进行离心( 1 000 rpm，5 min) ，并用McCoy＇s 5a 培养基清洗 1 次。最后所得的细胞用TIC 培养基( McCoy＇s 5a 培养基+10% 胎牛血清+100 IU/ml青霉素+ 0. 1 mg/ml 链霉素) 重悬，接种于24 孔板或Transwell 滤膜( Corning，#3422) 底侧面( 倒置于12 孔板中) ，每孔细胞数约为1 × 105个，置于37℃、95% O2～5% CO2培养箱中培养24 h，细胞贴壁后将Tranwell 按正常位置置于24 孔板中，加入TIC培养基。

1. 4 窦前卵泡的分离用29 号胰岛素针针头针刺14 ～16 日龄C57BL /6 雌鼠的卵巢，分离得到窦前卵泡，置于维持液( －MEM 培养基+1%FBS +100 IU/ml青霉素+ 0. 1 mg/ml 链霉素) 中，37℃、95% O2～5% CO2培养箱中孵育30 min。选择具备以下特征的

健康卵泡用以下一步包埋或培养: ①直径在110 ～140 μm之间; ②具有完整连续的基底膜，无明显因操作造成的卵泡损伤; ③卵泡中央可见一个未成熟的卵母细胞; ④无明显窦腔形成。

1. 5 卵泡与卵泡膜间质细胞的共培养

1. 5. 1 海藻酸钠凝胶法将卵泡膜间质细胞接种于24孔板底部，孵育过夜，更换卵泡生长培养基( －MEM培养基+ 10%FBS +ITS +10 mIU/ml FSH +100 IU/ml 青霉素+ 0. 1 mg/ml 链霉素) ，600 l/孔。将5 个窦前卵泡转移至2% ( w/v) 无菌海藻酸钠液珠中，充分浸入包埋液( 50 mM CaCl2+ 140 mM NaCl) 中交联2 min形成凝胶，再将海藻酸钠胶珠置入24 孔板内，记为共培养第零天。

1. 5. 2 Transwell 间接接触法将卵泡膜间质细胞接种于24 孔板底部，更换500 μl 卵泡生长培养基，放入Transwell 小室，加入100 μl 卵泡生长培养基，直接吸取 5 个卵泡转移至上室内。

1. 5. 3 Transwell 直接接触法将培养于Transwell 小室底侧面的卵泡膜间质细胞置于500 μl 卵泡生长培养基中，直接吸取5 个卵泡转移至含100 μl 卵泡生长培养基的上室内。

1. 5. 4 培养基更换每组包含20 ～30 个卵泡，于37℃、95% O2～5% CO2培养箱中培养 6 天，隔天半量更换新鲜配制的卵泡生长培养基，收集培养基冻存于－80℃，用于激素检测。

1. 6 评价方法

1. 6. 1 卵泡形态、直径、存活率监测〔7〕: 从第1 天开始，隔天用倒置相差显微镜观察卵泡形态并拍照，用ImageJ 软件测量卵泡直径( 取长轴和短轴的平均值) 。通过观察卵泡形态判断是否存活，将具有以下特征的卵泡视为死亡卵泡: ①卵泡或卵母细胞碎裂、皱缩，尺寸缩减; ②卵母细胞不再由颗粒细胞层包绕; ③颗粒细胞变暗或碎裂。

1. 6. 2 激素分析收集共培养第2、4、6 天1 /2 的培养基冻存于－80℃冰箱，用直接化学发光法测定睾酮、雌二醇。

1. 6. 3 卵母细胞的减数分裂能力评价〔7 －8〕: 培养结束后，用含10IU/ml 海藻酸钠裂解酶的－MEM 培养基替换原有的培养基，在37℃、95% O2～5% CO2培养箱中孵育30 min。将卵泡从裂解的海藻酸钠凝胶中转移至成熟培养基( maturation medium: －MEM 培养基+ 10% FBS + 5 ng/ml EGF + 1. 5 IU/ml hCG +100 IU / ml青霉素+ 0. 1 mg / ml 链霉素) 中，在37℃、95% O2～5% CO2培养箱中孵育16 ～20 h，进行体外成熟( IVM，in

vitro maturation) 。然后用0. 3% 透明质酸酶处理卵泡，并用吸管轻轻吹打，使卵母细胞从卵泡中裸露出来。观察卵母细胞并按以下方法进行分类: ①生发泡期( GV，germinal vesicle) : 卵母细胞在hCG 的作用下未恢复减数分裂，可见卵母细胞的细胞核持续存在; ②生发泡破裂期( GVBD) : 卵母细胞核膜消失，生发泡不可见; ③减数第二次分裂期( MII，metaphase II) : 卵母细胞恢复减数分裂，停滞在减数第二次分裂期，在卵母细胞周围可见第一极体; ④退化( DG，degenerated) : 卵母细胞碎裂或皱缩。

1. 7 统计分析所有实验均独立重复5 遍以上，运用SPSS 18. 0 统计软件进行数据处理与分析，计量资料采用( x ± s) 表示，卵泡直径、激素水平的组间比较采用单因素方差分析( ANOVA) ，卵泡存活率和减数分裂阶段采用χ2检验，P ＜0. 05 表示有统计学差异。

2 结果

2. 1 3 种共培养方法下卵泡的生长发育海藻酸钠凝胶包埋的卵泡在体外培养的6 天

中始终维持了卵泡的三维结构，并可以清晰观察到卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞( 图1A －C) 。培养结束时可以观察到处于偏心位置的卵母细胞，部分卵泡的卵母细胞周围可见窦腔形成，而在Transwell 中培养的两组，镜下观察到卵泡结构较不清晰，颗粒细胞与卵泡膜细胞的分界不清，在培养到第 3 天开始，卵泡内的颗粒细胞开始贴壁生长，卵泡直径急速增加，培养到第5 天时，部分卵泡的颗粒细胞向外扩散增殖，导致卵泡结构的破坏，而这种现象在海藻酸钠凝胶法中的发生率很低。在 3 种共培养方法中，卵泡的生长发育均呈现出两个阶段( 图2) : 培养第5 天前，卵泡生长缓慢，之后卵泡则开始加速生长。在起始卵泡直径控制在110 ～140 μm 的前提下，在培养的第 1 天、第 3 天各组间卵泡直径均无统计学差异( P ＞0. 05) ，卵泡存活率也无统计学差异( 分别为91. 1%、89. 1%、88. 2% ) ，见表1。在培养到第5 天时，海藻酸钠凝胶法的卵泡生长加速幅度明显低于Transwell 内的两组，使得三维培养的卵泡直径小于Transwell 内的卵泡( 180. 3 ± 39. 6) 、( 209. 4 ± 59. 3) 、( 226. 4 ±62. 6) μm，P ＜0. 05，而Transwell 直接接触法和间接接触法之间无统计学差异。第 5 天的卵泡存活率也出现差异，海藻酸钠凝胶法( 77. 3%) 和Transwell直接接触法( 76. 5%) 要高于Transwell 间接接触法( 57. 4%) ，P ＜0. 05，海藻酸钠凝胶法和Transwell 直接接触法之间无统计学差异。【表1】