基因工程和基因组学-(2)PPT课件

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PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR三步曲
变性 90～97℃ 退火 45～55℃
变变
延伸 72℃左右
90变95变
70变75变
变变
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变变 40变60变
90 0 C 50 0 C 70 0 C
PCR 操作流程
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PCR 的三个步骤为一次循环，约需5 －10 分钟。每经一次循环，所找到的 目的基因扩充一倍。经过 20 次循环， 即可扩增 106 倍，总共只需几个小时。
4、逆转录酶
RNA
DNA
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三 载体
一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA 连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才 可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并在其中 复制、扩增、克隆出多个拷贝。
可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、 细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。
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1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白
药物
1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全
部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程
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一 基因工程概述
★３、基本过程：
⑴ 从供体细胞中分离出目的基因；(简 称“切”)
⑵ 用DNA连接酶将含有外源基 因的DNA片断接到载体上，形 成DNA重组分子(“接”)；
第一节 基因工程(Genetic Engineering)
一 基因工程概述 二 限制性内切核酸酶 三 载体 四 基因的分离与鉴定 五 基因工程的应用
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一 基因工程概述
★遗传工程
广义
细胞工程、 染色体工程、 细胞器工程等
狭义： 基因工程
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一 基因工程概述
★1、概念：
是指将一种或多种生物体（供体）的基因与 载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物 体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达 出新的性状。
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1 限制性内切核酸酶
★限制性酶据其作用特点，可分为两类。
⑴第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链 DNA分子，没有序列特异性。
⑵第Ⅱ类限制性酶：
能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA 的特异序列。
其识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’ 方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。
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4.1 目的基因的获取
目的基因的获取大概有以下途径：
1化学合成法
如已知目的基因的核酸序列，则可以利用化学合成 法进行人工合成。
2 基因组DNA可以从基因中筛选出目的基因。.29
3 cDNA法
通过提取mRNA，然后进行反转录得到目的基因。
4 PCR法
用特异的引物，通过聚合酶链式反应来扩增目的基因。
该类能识别双链DNA分子中一段特异的核苷 酸序列，并将双链DNA分子切断。
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工具酶
常用的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成 5′磷酸化、探针标记
3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
这种序列称为回纹对称序列(palindrome)。
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2 DNA聚合酶
DNA聚合酶的主要作用是在体外大量合成目的基因
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3、DNA连接酶
在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这 种酶能够催化DNA中相邻的 3’一OH和5’一磷酸 基末端之间形成磷酸二酯键。
也称为DNA重组技术(DNA Recombination)、 或 分子克隆(Molecular cloning)
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基因工程的基本操作程序包括： (1) 目的基因的分离或合成； (2) 用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工
处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子； (3)把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和
载体上其他基因得以表达； （4）转化体细胞的扩增； （5）重组体细胞的鉴定与筛选。
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一 基因工程概述
★2、诞生：
1971年，美国Smith,H.O. 等分离出一种 限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；
1972年：Ｂerg, P. 等 实现不同酶切DNA片 段的体外连接；
1973年：Cohen,s.等将体外重组的DNA 转入 大肠杆菌细胞并得以表达。
⑶ 借助细胞转化手段将DNA重 组分子导入受体细胞(“转”)；
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一 基因工程概述
★３、基本过程：
⑷ 培养转化细胞，以扩增DNA重 组分子，使其整合到受体细胞 的基因组中（ “增”）；
⑸ 鉴定转化细胞，获得外源基因 高效表达的细胞（ “检”）；
由此可见，基因工程的操作过程可 简化为：
“切、接、转、增、检”
☆这些质粒的适应范围广，拷贝数 多。进入宿主细胞复制后，每个细 胞的质粒拷贝数可高达1000个。
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2. λ噬菌体
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3. 柯斯质粒
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4. 穿梭载体
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5. 细菌人工染色体
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6. 酵母人工染色体
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7. Ti质粒及其衍生载体
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4 重组DNA技术基本原理
4.1 目的基因的获得 4.2 目的基因和载体的连接 4.3 重组DNA导入受体菌 4.4 筛选转化子 4.5 克隆基因的表达
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三 载体
★作为载体DNA分子，需具备四个条件： ⑴具复制原点(ori)，
能携带的外源DNA片段独立地自我复制；
⑵具有多克隆位点，即具有多种限制性酶的 切点，用于克隆外源DNA片段；
⑶至少具有一个选择标记基因；
⑷易从宿主细胞中回收。
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1. 细菌质粒
◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染 色体而自然存在的、能自我复制、 易分离和导入的环状双链DNA分子。
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❖ 基因克隆示意图
载体DNA (限制性内切酶切开)
目的基因
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细
繁殖 阳性克隆株
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表达 9
二 限制性内切核酸酶
★限制性内切核酸酶或限制性酶： (restriction enzymes)
在细菌中此酶的功能是降解外来DNA分子， 以限制(restriction )或阻止病毒侵染。