第二章--微生物发酵制药常用菌种的分离-2015-3
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微生物发酵制药常用菌种的分离
工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵 工艺和后提取工艺三个因素。
拥有良好的生产菌种是提高生产水平的前提，除 了提高产量，菌种选育还能提高产品质量、改善 加工工艺和开发新产品。
在科学研究中通过菌种选育还可以了解菌种的遗 传学性质，因此，在生产和科研中，菌种选育都 具有重要意义。
知识目标
1、了解工业发酵制药常见微生物及其代谢物。 2、了解各种菌种保藏原理以及主要菌种保藏机构。 3、理解次级代谢产物与初级代谢产物的关系。 4、理解工业发酵对生产菌种的要求及菌种来源。 5、掌握自然选育、诱变育种的操作要点。 6、掌握菌种保藏中常用方法的操作要点。
能力目标
1、能利用自然选育技术对生产菌 种进行纯种分离或复壮。
2、能利用诱变育种技术对生产菌 种进行紫外诱变或化学诱变选育。
3、能对生产菌种进行合理保藏。
第一节 工业发酵生产菌种
一、工业发酵微生物及其代谢产物 （一）微生物代谢产物的类型
1、初级代谢产物 2、次级代谢产物
初级代谢和初级代谢产物
初级代谢主要是指把营养物质转化为 机体结构和生理活性物质以及提供能 量的代谢作用。微生物通过初级代谢 途径产生自身生长繁殖所必需的代谢 产物称之为初级代谢产物。如氨基酸、 核苷酸、蛋白质、多糖等。
次级代谢和次级代谢产物
次级代谢是指微生物在一定的生理阶段出 现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为 了避免在代谢过程中某些代谢产物累积造 成的不利作用而产生的一类有利于生存的 代谢类型。次级代谢产物是通过次级代谢 合成的产物，通常在生产后期合成，如抗 生素、色素、激素、毒素等。
3、次级代谢产物 和初级代谢产物的关系
对产生菌的生长繁殖作用不同， 但生物合成途径是相互关联的，初 级代谢产生的一些小分子化合物是 次级代谢途径的原料。
从代谢途径看，次级代谢产物是以初级代谢 产物作为前体衍生出来的。菌体代谢过程中 产生的某些中间产物既可以合成初级代谢产 物，也可以合成次级代谢产物，这些中间产 物称为“分叉中间体”。
从酶学关系看，有些酶具有通用性，此外， 某些初级产物对次级产代谢有一定调节作用。
从遗传控制看，初级代谢与次级代谢都受到 核内遗传物质的控制，抗生素合成受到核外 遗传物质质粒的控制，称为“质粒产物’’。
（二）工业发酵常见微生物及其代谢产物
常见微生物 1、细菌 2、放线菌 3、酵母菌 4、霉菌
1.细菌（bacteria）及其代谢产物
醋杆菌属（Acetobacter）：醋酸、山梨醇 乳杆菌属（Lactobacillus）：乳酸、乳制品 芽孢杆菌属（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、
淀粉酶、蛋白酶、果胶酶
假单胞菌属（Pseudomonas ）：维生素B12、
色素
黄单胞菌属（Xanthomonas）：维生素B12、
黄原胶
2.放线菌（actinomyces）及其代谢产物
主要代谢产物是抗生素（antibiotic） ：链
霉素、土霉素、金霉素、卡那霉素等，此 外还用于维生素和酶制剂的生产。
• 链霉菌（Streptomyces） • 小单孢菌属（Micromonospora）
3、霉菌（mould）及其代谢产物
（1）曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus） （2）青霉属（Penicillum）
（3） 根霉属（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis） （4） 红曲霉属（Monascus）
霉菌菌落
霉菌菌落
4、酵母（yeast）及其代谢产物
1. 酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
2. 假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）
3. 毕赤酵母属（Pichia）
含丰富的蛋白质、维生素、酶，制造单细胞 蛋白、酿酒
5、其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom）
2. 藻类（alga）
二、工业发酵对生产菌种的一般要求
1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。 2.易控制培养条件，糖浓度、pH、温度、溶解 氧 3.生长迅速、产物生成快，发酵周期较短。 4、选择单产高的营养缺陷型突变株或野生菌株 5.选择抗杂菌和噬菌体的能力强的菌株。 6.不易变异和退化，不产生任何有害物质和
毒素。
三、工业发酵生产菌种来源
1、从自然界分离筛选。 2、从菌种保藏机构获得。 3、从生产过程中已有菌株筛
选发生正突变的优良菌种。
第二节 生产菌种的选育
发酵工业所需优良菌种都是 通过菌种选育获得的，菌种 选育方法主要包括自然选育、 诱变选育、杂交育种和基因 工程育种。
一、自然选育
在生产过程中，不经过人工诱变处理， 利用菌株的自发突变而进行菌种筛选的 过程，称为自然选育或自然分离。
自然选育的菌种来源于自然界、菌种保 藏机构或生产过程，其中从自然界选育 菌种过程较为复杂。
自然选育的主要步骤
1.采样：有针对性地采集样品 2.增殖培养：人为地通过控制养分或 培条件，使所需菌种增殖培养后，在 数量上占优势 3.培养分离：利用分离技术得到纯种 4.筛选或毒性鉴定：进行生产性能测 定和毒性测定
（一）采样
1、采样地点：以土壤为主，也可以是植
物、腐败物品、水域
2、采样地点确定方法：
3、采样方法：去除表层5厘米左右浮土， 取5-25cm处的土样10-25g，装入事先准 备好的无菌塑料袋内扎好，记录采样时间、 地点、土壤质地、植被名称以及具体的环 境条件，以备查考，并尽快分离。
（二）富集培养
由于采集样品中各种微生物数量有很大差 异，要分离的菌种数量不多时，就要人为增 加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富 集培养。 常用富集培养方法： （1）控制培养基成分 （2）控制培养条件 （3）抑制不需要的菌类
（三） 纯种分离
（1）划线分离法：简单、快捷。 （2）稀释分离法：菌落单一均匀。 （3）组织分离法：适用于高等真菌
1、划线分离法操作步骤
工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵 工艺和后提取工艺三个因素。
拥有良好的生产菌种是提高生产水平的前提，除 了提高产量，菌种选育还能提高产品质量、改善 加工工艺和开发新产品。
在科学研究中通过菌种选育还可以了解菌种的遗 传学性质，因此，在生产和科研中，菌种选育都 具有重要意义。
知识目标
1、了解工业发酵制药常见微生物及其代谢物。 2、了解各种菌种保藏原理以及主要菌种保藏机构。 3、理解次级代谢产物与初级代谢产物的关系。 4、理解工业发酵对生产菌种的要求及菌种来源。 5、掌握自然选育、诱变育种的操作要点。 6、掌握菌种保藏中常用方法的操作要点。
能力目标
1、能利用自然选育技术对生产菌 种进行纯种分离或复壮。
2、能利用诱变育种技术对生产菌 种进行紫外诱变或化学诱变选育。
3、能对生产菌种进行合理保藏。
第一节 工业发酵生产菌种
一、工业发酵微生物及其代谢产物 （一）微生物代谢产物的类型
1、初级代谢产物 2、次级代谢产物
初级代谢和初级代谢产物
初级代谢主要是指把营养物质转化为 机体结构和生理活性物质以及提供能 量的代谢作用。微生物通过初级代谢 途径产生自身生长繁殖所必需的代谢 产物称之为初级代谢产物。如氨基酸、 核苷酸、蛋白质、多糖等。
次级代谢和次级代谢产物
次级代谢是指微生物在一定的生理阶段出 现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为 了避免在代谢过程中某些代谢产物累积造 成的不利作用而产生的一类有利于生存的 代谢类型。次级代谢产物是通过次级代谢 合成的产物，通常在生产后期合成，如抗 生素、色素、激素、毒素等。
3、次级代谢产物 和初级代谢产物的关系
对产生菌的生长繁殖作用不同， 但生物合成途径是相互关联的，初 级代谢产生的一些小分子化合物是 次级代谢途径的原料。
从代谢途径看，次级代谢产物是以初级代谢 产物作为前体衍生出来的。菌体代谢过程中 产生的某些中间产物既可以合成初级代谢产 物，也可以合成次级代谢产物，这些中间产 物称为“分叉中间体”。
从酶学关系看，有些酶具有通用性，此外， 某些初级产物对次级产代谢有一定调节作用。
从遗传控制看，初级代谢与次级代谢都受到 核内遗传物质的控制，抗生素合成受到核外 遗传物质质粒的控制，称为“质粒产物’’。
（二）工业发酵常见微生物及其代谢产物
常见微生物 1、细菌 2、放线菌 3、酵母菌 4、霉菌
1.细菌（bacteria）及其代谢产物
醋杆菌属（Acetobacter）：醋酸、山梨醇 乳杆菌属（Lactobacillus）：乳酸、乳制品 芽孢杆菌属（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、
淀粉酶、蛋白酶、果胶酶
假单胞菌属（Pseudomonas ）：维生素B12、
色素
黄单胞菌属（Xanthomonas）：维生素B12、
黄原胶
2.放线菌（actinomyces）及其代谢产物
主要代谢产物是抗生素（antibiotic） ：链
霉素、土霉素、金霉素、卡那霉素等，此 外还用于维生素和酶制剂的生产。
• 链霉菌（Streptomyces） • 小单孢菌属（Micromonospora）
3、霉菌（mould）及其代谢产物
（1）曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus） （2）青霉属（Penicillum）
（3） 根霉属（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis） （4） 红曲霉属（Monascus）
霉菌菌落
霉菌菌落
4、酵母（yeast）及其代谢产物
1. 酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
2. 假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）
3. 毕赤酵母属（Pichia）
含丰富的蛋白质、维生素、酶，制造单细胞 蛋白、酿酒
5、其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom）
2. 藻类（alga）
二、工业发酵对生产菌种的一般要求
1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。 2.易控制培养条件，糖浓度、pH、温度、溶解 氧 3.生长迅速、产物生成快，发酵周期较短。 4、选择单产高的营养缺陷型突变株或野生菌株 5.选择抗杂菌和噬菌体的能力强的菌株。 6.不易变异和退化，不产生任何有害物质和
毒素。
三、工业发酵生产菌种来源
1、从自然界分离筛选。 2、从菌种保藏机构获得。 3、从生产过程中已有菌株筛
选发生正突变的优良菌种。
第二节 生产菌种的选育
发酵工业所需优良菌种都是 通过菌种选育获得的，菌种 选育方法主要包括自然选育、 诱变选育、杂交育种和基因 工程育种。
一、自然选育
在生产过程中，不经过人工诱变处理， 利用菌株的自发突变而进行菌种筛选的 过程，称为自然选育或自然分离。
自然选育的菌种来源于自然界、菌种保 藏机构或生产过程，其中从自然界选育 菌种过程较为复杂。
自然选育的主要步骤
1.采样：有针对性地采集样品 2.增殖培养：人为地通过控制养分或 培条件，使所需菌种增殖培养后，在 数量上占优势 3.培养分离：利用分离技术得到纯种 4.筛选或毒性鉴定：进行生产性能测 定和毒性测定
（一）采样
1、采样地点：以土壤为主，也可以是植
物、腐败物品、水域
2、采样地点确定方法：
3、采样方法：去除表层5厘米左右浮土， 取5-25cm处的土样10-25g，装入事先准 备好的无菌塑料袋内扎好，记录采样时间、 地点、土壤质地、植被名称以及具体的环 境条件，以备查考，并尽快分离。
（二）富集培养
由于采集样品中各种微生物数量有很大差 异，要分离的菌种数量不多时，就要人为增 加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富 集培养。 常用富集培养方法： （1）控制培养基成分 （2）控制培养条件 （3）抑制不需要的菌类
（三） 纯种分离
（1）划线分离法：简单、快捷。 （2）稀释分离法：菌落单一均匀。 （3）组织分离法：适用于高等真菌
1、划线分离法操作步骤