灰树花多酚的提取和活性研究

试验结果显示灰树花多酚可抑制α2淀粉酶活性 ,减少酶对淀粉的水解. 树脂法适合从灰树花菌丝
体中提取多酚类物质 ,灰树花多酚具有抗氧化 、抗菌及抑制α2淀粉酶等活性.
关键词 : 灰树花菌丝体 ;多酚 ;大孔树脂 ;活性
中图分类号 : S 567. 3
文献标识码 : A
Extraction and Activities of Polyphenol from Gri f ol a f r ondos a Mycelium
第200254年卷第7 月4
期
食
Journal of
品与 Food
生物技术 Science and
学报 Biotechnology
Vol .
J
24 ul .
No . 4 2005
文章编号 :167321689 (2005) 0420026205
灰树花多酚的提取和活性研究
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食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 24 卷
品 ,37 ℃结合 10 min ,加入 1 mL 1 %可溶性淀粉溶 液. 37 ℃恒温反应 5 min. 碘呈色法 :反应液加碘显 色 ,测定 660 nm 处的吸收值. 3 , 52二硝基水杨酸 (DN S) 比色法 : 反应液加入 1 mL DN S 试剂 ,在沸 水浴上加热 10 min ,冷却后稀释至适当的倍数 ,在 520 nm 测定吸收值.
将间苯三酚配成标准溶液 (125 μg/ mL ) . 取 0. 00 、0. 05 、0. 15 、0. 25 、0. 35 、0. 45 mL 置于 15 mL 试
管中 ,加水稀释至 7 mL , 混合均匀 , 加入 0. 5 mL Folin2Denis 试剂摇匀 ,3 min 后加入 2 mL 饱和碳 酸钠 溶 液 定 容 至 10 mL , 混 合 充 分. 测 定 波 长 680 nm处的吸光值. 灰树花样品的测定操作同标准 曲线[ 8 ] . 1. 5 体外抗菌活性试验 1. 5. 1 平板打孔法 将培养好的试验菌用无菌水 稀释至所需浓度 ,加入恒温于 55 ℃左右的灭菌培 养基 ,制成含菌平板. 打孔 ,注入不同浓度的灰树花 样品溶液 ,37 ℃培养 24 h. 1. 5. 2 平板倍比稀释法 吸取适量不同浓度的灰 树花样品溶液置无菌平皿中 ,加入恒温于 55 ℃左 右的灭菌培养基 ,混合铺平板. 将培养好的试验菌 适当稀释 ,用多点接种仪接至各平板 ,37 ℃培养 24 h 观察记录 M IC 值[9] . 1. 6 抗氧化活性试验 1. 6. 1 对红细胞自氧化溶血的影响 红细胞取自 小鼠眼眶静脉丛 ,用生理盐水洗 3 次 ,然后配成 1 % 红细胞悬液. 取红细胞悬液 1 mL ,加入含不同质量 浓度样品的生理盐水溶液 20 μL (终质量浓度分别 为 0. 075 ,0. 15 ,0. 30 ,0. 60 mg/ mL) ,以不加药组为 对照组 ,加入生理盐水 20μL . 以维生素 C 为阳性对 照 ,终质量浓度为 0. 1 mg/ mL . 37 ℃温育 24 h 后 , 2500 r/ min 离心 10 min ,540 nm 处测定吸光度. 以 对照组为 100 %溶血 ,计算溶血度. 1. 6. 2 对 H2 O2 所致红细胞氧化溶血的影响 取 上述红细胞悬液 1 mL ,加入不同质量浓度样品 (终 质量浓度分别为 0. 075 ,0. 15 ,0. 30 ,0. 60 mg/ mL ) 及 H2 O2 (体积分数为 1 %) . 以维生素 C 为阳性对 照 ,终质量浓度为 0. 1 mg/ mL . 37 ℃温育 1 h 后 , 2500 r/ min 离心 10 min ,415 nm 处测定吸光度. 以 H2 O2 + 红细胞为对照组 ,同时设正常红细胞组. 1. 6. 3 对小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响 迅速取 小鼠肝置于 4 ℃生理盐水中 ,洗去表面残血 ,制成 5 %的肝匀浆. 取肝匀浆 0. 5 mL ,加入灰树花多酚 0. 5 mL ( 终质量浓度分别为 0. 25 , 0. 5 , 1. 0 mg/ mL) ,以不加药组作为对照管 ,加入生理盐水 0. 5 mL . 每管加入 50 μL 体积分数 3 % H2 O2 ,混匀 ,37 ℃温育 2. 5 h. 按试剂盒说明书操作 ,721 型分光光 度计 532 nm 处比色测定. 蒸馏水调零 ,以四乙氧基 丙烷为标准 ,计算每毫升溶液中丙二醛 (MDA) 的生 成量. 1. 7 对α2淀粉酶的抑制试验
灰树花是一种药 、食兼用的珍稀真菌 ,具有广 泛的药理 活 性[1 ] , 如 抗 肿 瘤[2 ] , 抗 糖 尿 病[3 ] , 抗 氧
化[4 ] ,以及抗辐射[5 ] ,调节免疫功能[6 ] 及抗菌[7 ] 等. 灰树花发酵菌丝体粗提物呈黄褐色 ,含有大量有色
收稿日期 :2005201221 ; 修回日期 :2005203218. 基金项目 :教育部高等学校科技创新工程重大项目 (130105) 资助课题.
Abstract :GF polyp henol was ext racted f ro m Gri f ol a f ron dosa mycelium and it s p harmacolo gical f unctio ns were determined in t his paper. Brown powder was ext racted using low2polar macroporo us adsorptio n resin an百度文库 it s main ingredient was identified as polyp henol , by ult raviolet , IR spect ro meter and p henol identif y test . GF polyp henol showed inhibitory activities to bacteria such as S . au reus in vit ro using plates serial dilutio n met ho d. Hemolysis of red bloo d cell o xidatio n and lipid perocidatio n of mice liver ho mo genate met hods were used to determine it s antio xidatio n activities. GF polyp henol inhibited o xidatio n of red blood cell and MDA p roductio n of mice liver ho mo genate. GF polyp henol reduced hydrolysis of starch by alp ha amylase using I2 and DN S met hod. It is suitable to use resin to ext ract GF polyp henol . GF polyp henol showed antio xidatio n , antibacteria and alp ha2amylase inhibitio n activities. Key words : Gri f ol a f ron dos a mycelium ; polyp henol ; resin ; activities
陈向东 , 刘晓雯 , 吴梧桐 3
(中国药科大学 生命科学与技术学院 ,江苏 南京 210009)
摘 要 : 从灰树花菌丝体中提取多酚类物质 ,并研究其性质和活性. 采用弱极性的大孔吸附树脂从
灰树花菌丝体粗提物中吸附多酚类物质 ,吸附量大 ,解吸容易 ,获得褐色粉末状产物 ,应用红外 、紫
外扫描和鉴别试验证明其主要为多酚类物质 ,用 F2D 法以间苯三酚为标准测得酚类物质质量分数
为 9. 3 %. 平板系列稀释法测定体外抗菌活性 ,灰树花多酚对金黄色葡萄球菌等具一定的抑制作
用. 红细胞氧化溶血和 MDA 试验测定其抗氧化活性 ,实验显示 :对于红细胞的自氧化和 H2 O2 所致
的氧化均具有一定的抑制活性 ,可显著抑制小鼠肝匀浆自发生成 MDA . 碘呈色法和 DN S 比色法
金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌等临床分离株 : 中 国药科大学微生物学教研室保存. 1. 2 灰树花多酚的提取分离 1. 2. 1 热水提取 灰树花菌丝体粗提物粉末 ,10 倍质量的热水浸提 ,离心取上清即水提液. 1. 2. 2 树脂的预处理 新树脂以体积分数为 95 % 的乙醇及稀酸 、稀碱等处理 ,水洗至中性 ,离子交换 树脂转为 Cl 型备用. 1. 2. 3 静态吸附与洗脱实验 量取一定体积已处 理的树脂 ,精确加入适当稀释的水提液 , 25 ℃摇床 震荡 24 h 后 ,滤出液体 ,树脂再加入一定体积的体 积分数为 95 %乙醇 ,于 25 ℃震荡解吸. 分别测定树 脂吸附前后和乙醇解吸后的水提液 280 nm 的吸收 值 ,按下式计算吸附率 Q 及解吸率 R . Q = ( A0 A S ) / A0 ×100 % , R = A j / A0 ×100 %. 其中 , A0 为吸 附前初始吸收值 , A S 为吸附后吸收值 , A j 为解吸后 吸收值. 1. 2. 4 吸附动力学实验 根据树脂的静态吸附量 对时间作出吸附动力学曲线 ,分析树脂的吸附特性 及吸附速率. 1. 2. 5 灰树花多酚的分离 乙醇解吸液旋转蒸发 浓缩至干 ,加水溶解 ,用乙酸乙酯萃取 ,萃取液旋转 蒸发挥去乙酸乙酯 ,得到固体提取物 ,作为理化性 质和活性研究的样品. 回收乙醇和乙酸乙酯. 1. 3 灰树花多酚的理化性质测定 1. 3. 1 紫外扫描 样品 0. 2 mg/ mL 水溶液在 200 ～400 nm 进行紫外扫描. 1. 3. 2 红外扫描 样品 2 mg 以溴化钾压片 ,于 4000～400 cm21 进行扫描. 1. 3. 3 鉴别试验 样品分别用茚三酮 、三氯化铁 、 溴水 、明胶和香草醛2盐酸等试剂进行鉴别反应. 1. 4 酚类定量测定
作者简介 : 陈向东 (19692) ,女 ,江苏靖江人 ,副教授 ,微生物与生化药学博士研究生 ; 3 通讯作者.
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α2淀粉酶用磷酸缓冲液配制成 1 mg/ mL 溶液 , 取 0. 25 mL 分别加入 100 、200 μg 灰树花多酚样
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第 4 期
陈向东等 :灰树花多酚的提取和活性研究
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物质 ,作者应用大孔树脂从灰树花菌丝体粗提物中 提取分离有色部分 ,经鉴别为多酚类物质 ,并对活 性进行了初步研究.
1 材料与方法
1. 1 实验材料 灰树花菌丝体粗提物 ,山东京博生物科技公司
提供 ;大孔树脂 :天津南开大学化工厂产品 ;α2淀粉 酶 :50 u/ mg , 中国医药集团上海化学试剂公司产 品 ;MDA 试剂盒 ,南京建成生物工程公司产品 ; 其 余试剂均为国产分析纯.
C H EN Xiang2do ng , L IU Xiao2wen , WU Wu2to ng 3
( The School of Life Science and Technology , China Pharmaceutical U niversity , Nanjing 210009 , China)