树舌胞外多糖分离纯化实验方案(精)

透析

一、透析袋的前处理

1.把透析袋剪成适当长度(20cm的小段,将透析袋煮沸10分钟。

2.用蒸馏水彻底清洗透析袋。(以后的每步操作必须戴一次性手套

3.冷却后,存放于4℃,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

4.用前在透析袋内装满水然后排出,将之清洗干净。

二、透析的步骤

将多糖溶液浓缩(用旋蒸仪浓缩后,高速离心8000rpm,4℃下10分钟,装入透析袋中,排出空气,用棉线扎口。悬挂在清水容器中,于4℃用蒸馏水透析48h。取出,冻干保存。

离子交换纤维素DEAE-52 柱层析

1、纤维素预处理:蒸馏水浸泡3~5h,抽滤,

0.5mol·L-1NaOH溶液浸泡3~5h,抽滤,NaOH溶液洗涤2~

4 次,蒸馏水清洗至中性,

0.5mol·L-1HCl溶液浸泡3~5h,抽滤,HCl溶液洗涤2~4次,

蒸馏水洗至中性,

0.5mol·L-1NaOH溶液浸泡,抽滤,NaOH溶液洗涤2~4次,

蒸馏水清洗至中性,溶解待用。

2、装柱:将处理好的纤维素溶于洗脱液中,浸泡3h后抽滤。再次

溶解,拌匀后用玻璃棒贴层析柱内壁引流(避免出现气泡装柱,用0.02mol磷酸盐缓冲液稳定12h左右。

3、上样:透析后的多糖溶液上纤维素DE-52层析柱,用0.2mol/L NaCl

和0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱,恒流泵控制流速约为1.4rpm(每分钟20滴,每管5mL收集。(收集后测试试管内是否有多糖,苯酚-硫酸法,2滴溶液+1滴6%苯酚+5滴浓硫酸,于显色皿观察,收集显黄褐色的试管溶液

苯酚-硫酸法:吸取0.2 ml的样品液,以蒸馏补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml 及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。

样品处理:将收集的样品浓缩到约50ml后,高速离心8000rpm,4℃下10分钟,再次透析(方法同上,收集样品于100ml烧杯,置于真空干燥箱干燥24~48h,取出样品,置于干燥器中待用

试剂的配制

1、0.5mol/L NaOH 0.5mol/L HCl

2、0.2 mol/L 、0.5mol/L NaCl

(58.44×0.2=11.688g/L 58.44×0.5=29.22g/L由相对应质量NaCl溶于0.02mol磷酸盐缓冲液配的

3、6%苯酚6g苯酚溶于100ml蒸馏水

4、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2磷酸氢二钠0.2mol/L Na2HPO472ml+ 磷酸二氢钠0.2mol/L NaH2PO4 28ml 使用时稀释10倍。

M(Na2HPO4=0.2*184*0.072=2.9664g

M(NaH2PO4=0.2*184*0028=1.0304g