翻译杂交释放与捕获技术——在翻译水平筛选重组子阳性克隆的方法论文-By_gnksguybb

翻译杂交释放与捕获技术——在翻译水平筛选重组子阳性克隆的方法
论文导读:：无细胞翻译系统主要含有：。假设一重组子X。配合蓝白筛选、PCR等方法来使用。
论文关键词：翻译杂交释放技术，翻译杂交捕获技术，无细胞翻译系统，重组子，筛选

1.引言
翻译杂交释放（Hybrid-Release Translation , HRT）技术和翻译杂交捕获（Hybrid-ARrest Translation , HART）技术，是鉴定克隆基因翻译产物的有效方法。两种方法都利用纯化的mRNA通过无细胞翻译系统（cell-free translationsystem）直接合成蛋白质。细胞裂解物，可以来自于发芽的小麦种子中，或者来自于兔网状细胞，都具有很强的合成蛋白的能力，含有蛋白质合成所必需的核糖体，tRNA和其他蛋白质合成所必需的分子。然后加入mRNA和必需的20种氨基酸，其中Met是35S标记的。mRNA被转录成放射性蛋白质的混合物，可以通过电泳分离，自显影显示出来。每一条带都代表mRNA所翻译的一种蛋白。
当有cDNA克隆存在时HRT和HART可以非常好的工作。在HRT中，首先将cDNA变性，结合到纤维素膜上或者尼龙膜上，加入mRNA样品，能与cDNA杂交的特异mRNA保留在膜上，除去未结合的分子后，可以收集mRNA并加到细胞外系统中生物论文，这样将产生cDNA编码的特异的蛋白质。
HART的不同点在于，HART并不除去未杂交的分子，而是将整个膜转入细胞外系统，杂交的mRNA不能直接翻译，所以除此之外，所有的mRNA都翻译。翻译产物中缺失的蛋白可以进行鉴定中国知网论文数据库。
2. 无细胞翻译系统（Cell-Free Translation System）
实验室中常用的无细胞翻译系统是麦芽胚（germinating wheat seeds）提取物和兔网织红细胞（rabbit reticulocyte cell）提取物，也有使用非洲爪蟾（Xenopus laeuis）卵母细胞体系的[1]。无细胞翻译系统主要含有：
（1）核糖体；
（2）tRNA；
（3）20种氨基酸，其中一种带有放射性标记（实验室中也经常使用35S-甲硫氨酸<35S-methionine>），供放射自显影检测之用；
（4）控制蛋白质合成的相关因子。
无细胞翻译系统主要有如下3点优越性：
（1）在无细胞翻译系统中，蛋白质合成的活性极高。
无细胞翻译系统就是一种人工制造的蛋白质“合成机器”， 其功能就是专门进行蛋白质的合成。相对于传统的宿主菌翻译系统而言，无细胞翻译系统不用考虑宿主菌本身的生活能力，只需大量合成目的蛋白质即可，效率极高[2]；
（2）专一性地翻译目的基因的序列。
与（1）相同，无细胞翻译系统不受到宿主菌的干扰。假设一重组子X，如果加入到无细胞翻译系统中，则

该系统只翻译重组子上有限的核酸序列，便于对目的基因及其表达产物进行分析。相反，如果将重组子X导入某一受体细胞，则表达产物将包括重组子与宿主细胞两方面的蛋白质，且后者将占绝大多数，给分析工作带来极大的不便；
（3）加入了放射性标记的氨基酸，有利于对翻译产物进行检测；
作为基因工程研究的重要手段，无细胞翻译系统的主要功能就是定向地合成所需蛋白质，并对其进行检测。常在系统的氨基酸底物中添加一种带有放射性标记的氨基酸，或者使用35S-甲硫氨酸（35S-methionine），便于翻译后的检测工作[3]。
3.HRT和HART
HRT和HART的技术思想是相同的，核心内容都是以目的基因的mRNA为操作对象，用放射自显影的方法检测其表达产物的有无，而其中的关键步骤，就是以目的基因为模板，获得该基因的cDNA生物论文，在杂交检测中作为探针使用。
在HRT中，目的基因与载体连接之后，将进行如下操作：
（1）将连接后的重组子加入到无细胞翻译系统中，进行转录、表达，提取mRNA；
（2）从提取的mRNA中取出一部分，以目的基因为模板设计引物、以 mRNA为底物进行RT-PCR，获得目的基因的cDNA；
（3）将cDNA固定在硝酸纤维素（nitrocellulose）或尼龙（nylon）膜上，作为杂交探针之用；
（4）将余下的RNA与上述cDNA混合、温育，然后进行非特异性的洗脱，即通过控制洗脱反应的条件，将那些不与cDNA发生特异性杂交的RNA分子洗脱掉；
（5）转变洗脱条件，进行特异性的洗脱；如果有mRNA分子与cDNA发生特异性的结合，则此mRNA将在这一步骤中被洗脱下来，并且此mRNA就是目的基因的转录产物；
（6）收集洗脱产物，加入到无细胞翻译系统中，通过蛋白质电泳和放射自显影（autoradiography）检测表达产物。
显而易见，由于使用了无细胞翻译系统，去除了大量的、与检测实验无关的mRNA分子，所以HRT的实验结果只有两个：
（1）只有一条放射性条带，即目的基因的最终表达产物。此结果表明：目的基因与载体成功连接并转化、能够在宿主菌中顺利表达；
（2）没有任何放射信号，检测结果为空背景。此结果表明：目的基因可能与载体成功地连接并转化，但不能顺利地表达。
而对于HART而言，该方法中只有一点与HRT不同：在HRT中，最终要对目的基因的表达产物进行检测；而在HART中，则是要对目的基因表达产物之外的蛋白质进行检测，具体步骤为：
（1）将连接后的重组子加入到无细胞翻译系统中，进行转录、表达，提取mRNA；
（2）从提取的RNA中取出一部分，以目的基因为模

板设计引物、以RNA为底物进行RT-PCR，获得目的基因的cDNA；
（3）余下的RNA再分成两部分，其中一部分与上述cDNA探针杂交，进行非特异性的洗脱生物论文，并将洗脱产物回收，而弃去与cDNA探针发生特异性杂交的mRNA。换言之，洗脱产物中已经特异性地去除了由目的基因转录的mRNA。将洗脱产物加入到无细胞翻译系统中进行表达，用蛋白质电泳和放射自显影技术检测其表达结果，记作结果-1；
（4）如（4）中所述，RNA分成两部分之后，一部分用于杂交。与此同时，将另一部分RNA直接加入到无细胞翻译系统中进行表达，用蛋白质电泳和放射自显影技术检测其表达结果，记作结果-2。
（5）结果-1和结果-2进行匹配，分析目的基因的转化情况。
同样，由于使用了无细胞表达系统，被检测的蛋白质种类少，仅限于载体所承载的表达信息，便于分析结果。结果-1和结果-2的比较，可以出现两种情况：
（1）结果-1仅仅比结果-2多一个条带，说明此条带就是目的基因的翻译产物，则可以推断转化实验是成功的；
（2）结果-1和结果-2完全相同，则至少说明目的基因不能顺利表达，转化实验不成功中国知网论文数据库。
以上是对HRT和HART总体技术思想的阐述。不难看出，HRT和HART的核心思想是完全相同的，不同的只是实现这一思想的具体方式[2]。在HRT中，是直接对目的基因的表达产物进行检测；而在HART中，则是对目的基因表达产物之外的蛋白质进行检测。图-1概括了两种方法的流程。从图中可以看出，HRT和HART的结果是互补的、互为“阳性”和“阴性”的。
4. 使用HRT和HART方法的相关问题
HRT和HART技术是在蛋白质水平检测重组子阳性克隆的方法，由于这两种技术的检测对象是目的基因的最终表达产物，故比起常见的蓝白筛选、PCR等基因水平检测技术而言，更直观、更严谨、更有说服力[1]。但是，从基因工程整体操作流程上看，对于重组子的检测只是其中的一部分，研究人员不可能将最主要的精力投入到检测工作中。而从上述对于HRT和HART操作步骤的介绍来看，作为检测手段生物论文，两种方法都过于繁琐，特别是频繁涉及对mRNA的操作，要特别注意对mRNA降解的预防，实验条件比较严格。
另外，虽然HRT和HART检测的是表达产物，在这一点上确实比蓝白筛选、PCR等基因水平检测技术更具有优越性，但是，在实际的工作中，研究人员完全可以利用Southern杂交、Northern杂交以及Western杂交等分子杂交手段，在基因工程操作的最后一步——重组子的表达阶段对蛋白质产物进行专门的检测。而在实际工作中，配合

蓝白筛选、PCR等方法来使用，HRT和HART技术使检测结果更加可信，达到一种“锦上添花”的效果。随着技术的不断完善，近来又在DNA水平检测方法上有了新的突破-HCII第二代杂交检测方法的问世，无疑是对杂交检测方法的灵敏度的改善【4】。除此之外，检测基因表达产物的方法还有cDNA微距阵杂交技术【5】，磁珠捕获技术【6】，，多重核酸扩增荧光技术【7】，应用反向斑点杂交技术【8】等。

：
[1]邱泽生主编.基因工程.北京：首都师范大学出版社，1993，125-128；
[2]T.A. Brown. Gene Cloning and DNA Analysis – An introduction.4th edition. US：Blackwell Science Ltd , 2002, 235-236；
[3]吴乃虎编著.基因工程原理.第2版.北京：科学出版社，2001，382-384；
[4]王秋伟,虞斌,许培箴.HPV DNA HCII检测在宫颈病变筛查中的应用. 山东医药,2009,44-45
[5]胡吉,王宣春,沈烨.采用cDNA 微阵列杂交技术对垂体瘤基因表达谱的研究.复旦学报，2005，565-569
[6]王卉放,许化溪.磁珠捕获技术在定量液相杂交中的应用.江苏大学学报（医学版）2003,285-288
[7]李晴,乌兰娜等.多重核酸扩增荧光检测技术在宫颈癌筛查中的效果评价.中国肿瘤，2009，315-318
[8]胡军勇,金卉等.应用反向斑点杂交技术从转录序列的选择性捕获中筛选副猪嗜血杆菌表达差异基因.农业生物技术学报，2009，189-194
参考文献 [1] 叶子，进．实现[J]．计算机工程与科学，2009，1(07)：61-64. [2] 基于MATLAB 实现的指纹图像预处理[J]．2008，34(04)：836-856. [3] /baomahuiyulecheng/ [4] /xianjindubo/ [5] By-gnksguybb [6] 李 宁．指纹增强算法研究[D]．济南：山东大学，2007. [7] 马扬彪．基于Gabor 滤波的指纹图像增强[J]. 微计算机信息，2009，25(15)：305-306. [8] 向 锐．面向低质量指纹的图像增强算法研究[D

]．重庆：西南政法大学，2008.