免疫电泳技术ppt课件

免疫固定电泳 免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis， IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。 Alfonso在1964年第一个报道了免疫固定技术 （IFE），1969年Alper与Johson相继报道了IFE在 铜蓝蛋白、lgG基因的多态性检测和C3激活后分子 转变中的应用
４.作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同， 火箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可 用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酸化），使本来带 两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速度， 抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。
免疫电泳
免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）技术， 是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫化学分析技 术。检测原理是将待测样品臵于琼脂糖凝胶上进行电泳， 样品中各蛋白质成分因分子量及电泳迁移率不同，被分 离成肉眼不可见的若干区带。停止电泳后，沿与电泳方 向平行的两侧开槽并加入抗血清。臵室温或37℃使两者 扩散，经18－24小时后，各区带蛋白在相应位臵与抗体 反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多，则反应沉淀线越 接近抗体槽，形成的沉淀弧线较粗，反之，则形成的沉 淀线较细。
３.光路 （1）透射光：其照明光线从标本下方经过聚光器会 聚后透过标本进入物镜。它适于观察对光可通透的 标本。 （2）落射光 （二）荧光分光光度计
常用的荧光色素有： １.异硫氰酸荧光素（fluoresceln isothiocya－nate， FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490－495nm， 最大发射光波长520－530nm，可呈现明亮的黄绿色荧 光。有两种同分异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定 性、与蛋白质的结合力等方面都更加良好，在冷暗干燥 处可保存多年。FITC是应用最广泛的荧光素。其主要优 点在于：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常标本中的绿 色荧光较少，有利于降低背景干扰。
（2）激光滤板：能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，以激发荧光色素。激发滤 光片有两种，UG为紫外光滤片，只允许波 长275－400nm的紫外光通过，最大透光度 在365nm。BG为蓝紫外光滤片，只允许波长 325－500nm的蓝紫外光通过，最大透光度 为410nm。
（3）吸收滤板：位臵是靠近目镜的一组阻挡滤光片 又称吸收滤光片或抑制滤光片，其作用是阻断激发 光而使发射的荧光透过，使标本在暗的背景上呈现 荧光易于观察，也使眼睛免受强激发光刺激。吸收 滤光片的透光范围为410－650nm，代号有OG（橙 黄色）和GG（淡绿黄色）两种。
以此可作细微的蛋白质组分分析。根据各蛋白 所处的电泳位臵，将沉淀弧的位臵、形态与已知标 准抗原、抗体生成的沉淀弧进行比较，可分析待测 样品中所含成分的种类及性质、例如，多发性骨髓 瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白 沉淀弧，而其他类型的免疫球蛋白形成的沉淀弧可 明显细、短于对照沉淀弧（图7－4）。
４.藻红蛋白（R-RE）是红藻和绿藻中一类被称为 藻蛋白（phycoblliprotein）家族中的一员，与 光合作用有关。其分子量为240000。其最强吸收 光波长为565nm，最大发射光波长为578nm。它在 488nm处的光吸收率为565nm处（最大的）的75％。 因此R-RE可以有效地与FITC一起用于双色免疫荧 光染色，因为它们可以共用488nm激发光。
火箭免疫电泳
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis， RIE）技术是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项 检测技术。
火箭电泳操作时应注意以下几点： １.所用琼脂要选择无电渗或电渗很小的，否则火箭 形状不规则。 ２.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的 云雾状或圆形皆提示未达终点。 ３.标本数量多时，电泳板应先臵电泳槽上，搭桥并 开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底 峰形，使定量不准。
免疫电泳技术
对流免疫电泳 （counter immunoelectrophoresis,CIEP）,原 理是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术，其在pH8.4以上的缓冲液中，大部分 蛋白质抗原成分带负电，在电场中向正极移动；而 作为抗体的IgG因其分子量大，暴露的极性基因较少， 解离也少，在电场中亦向正极缓慢移动，但电渗引 向负极移动的液流速度超过了lgG向正极的移动，带 动抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成乳白色沉 淀线，这就是电渗所致的IgG呈反向负极倒退。
第九章
荧光免疫技术
荧光免疫技术（fluoroimmnoassay）是将免疫 学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一 种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方 法。
荧光物质 （一）荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用做 荧光色素。只有那些能产生明显荧光的有机化合物 才能作为荧光色素。
２.四乙基罗丹明（rhodanune，RB200）为橘红色 粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定， 可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595－600nm，呈橘红色荧光。可与FITC 的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或 对比染色。但荧光效率较低。
３.四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiቤተ መጻሕፍቲ ባይዱcyanate，TRITC） 其最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光。荧光效率亦较低，但因其 荧光猝灭速度慢，除作衬染外，也可单独采用。
荧光免疫分析常用的仪器和设备
（一）荧光显微镜 荧光显微镜是荧光显微技术的基本工具。其主 要结构与普通光学显微镜基本相同，与普通显微镜 不同之处在于光源、滤板以及不吸收紫外线的聚光 器和镜头等。 １.光源
２.滤板 滤板的作用在于隔热、选择适宜的激发 光及选择适宜的检测光。按其作用分为隔热 滤板、激发滤板及吸收滤板。 （1）隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔 热。它安装在灯室聚光镜的前面。