基因编辑技术的概念和原理解析

基因编辑的优势
与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基 因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物 种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。
基因编辑原理
现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组修复(HDR) 两条途径。
传统的动物育种方法受到种源的限制，其程 需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫 长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难， 育种成果很难取得突破性进展。
基因编辑的研究背景
现代动物分子育种中，分子标记技术能够定位与经 济性状相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关 系，从而快捷可靠地对动物后代进行筛选。但是， 利用分子标记技术辅助筛选，改良的程度依然受限 于品种自身已有的基因。 所以，利用基因工程技术进行品种改良，可以突破 种源的限制及种间杂交的瓶颈，获取新品种，因此 分子育种更为本质和直接。
1. ZFN 基因组编辑技术
ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是 基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。 1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块，到1996 年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。 2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN 可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因 组编辑中的应用。
目前， TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势， 但仍然有些问题需要解决，例如:脱 靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。
基因编辑原理
基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： ◦人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术； ◦转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases， TALEN)技术； ◦RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas RGNs)。
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断 裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源 末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标 位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突 变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目 的。
基因编辑的研究背景
目前，获得突变体的常见方法是利用T- DNA 或转座子构建大规模的随机插入突 变体库， 但是构建覆盖全基因组的饱和突变体库需要的工作量大且耗费的时间 长。而通过定点突变的方法使目的基因完全失活，是一种最直接有效的研究特定 基因功能的方法。
基因编辑的研究背景
近年来，随着高特异性及更具操作性的人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基 因组编辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作推向高潮，使得定点基因敲除、 敲入变得更为简单且高效。
Baidu Nhomakorabea
2. TALEN 基因组编辑技术
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌 (Xanthomonas)中发现一种转录激活子样效应因子， 它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸 序列有较恒定的对应关系。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。 它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。
基因编辑技术的概念解析
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定 位到基因组的某一位点上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。 此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑了原有的基因组， 真正达成了 “编辑基因” 。
基因编辑的研究背景
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及 基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的 策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工 作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒 性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然 存在不同程度的脱靶效应。
TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标 位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成二 聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为12~20 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其 结合效果更佳。
基因编辑原理
非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修 复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生 碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失 活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基 因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂 DSB 位点，从而实现定点的基因敲入。
基因编辑原理
同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修 复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情 况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过 程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插 入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB， 在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因 的替换。