常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

通 讯 作者 ： 曾令 兵 Ｅｍ ｉ ｅｇｉｇｉｇ ｍ ｉ ｃｎ －ａｌ ｎｌ ｂｎ ＠ｇ ａｌ ｏｌ ：ｚ ｎ ．
第 ６期
徐百度文库
进 等 ：常规 Ｐ Ｒ与巢式 Ｐ Ｒ法快速检测克 氏原螯 虾白斑综 合征病毒 （ Ｓ Ｃ Ｃ ＷＳ Ｖ）
５ ３
忠 发 等 对 ＷＳＶ 的研 究 发 现 ，克 氏原 螯 虾 在 自 Ｓ
第３ ８卷
Ｖｏ． １３８
第 ６期
Ｎｏ ６ ．
淡
水
渔
业
２０ ０ ８年 １ 月 １
ＮＯ ．２ ｏ８ Ｖ ０
Ｆ ｅ ｈ ｔｒ Ｆ ｓ ｅ ｉｓ ｒ ｓ ｗａｅ ｉｈ ｒｅ
常 规 Ｐ Ｒ 与 巢 式 Ｐ Ｒ 法 快 速 检 测 克 氏原 螯 虾 Ｃ Ｃ 白斑 综 合 征 病 毒 （ Ｓ Ｖ） Ｗ Ｓ
ｅ ｔａ ｔｏ ｔ ｄ， ｔ ｍｐ ｏ ｅ ｔｏ ａ ｐ ｃｆｃｔ ｅｓ ｌ， ｈ ｇ ｍｐｌ ｃ ｔｏ ｆ ｃ ｅ ｃ ｘｒ ｃｉ ｎ ｍｅｈｏ ｈｅ ｉ ｒ ｖ ｄ ｍｅｈ ｄ ｈ ｄ ａ ｓ ｅ ｉ ｉ ｒ ｕｔ ｉ ｙ ｉｈ ａ ｉ ａｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ｙ， ｈ ｇ ａｅ ｏ ｃ ｒｃ ｎｄ ｉ ｆ ｉ ｉｈ ｒ ｔ ｆａ ｃｕ ａ ｙ ａ ｃ ｕ ｄ ｂ ｐｐ ｉｄ ｆｒｒ ｐ ｄｙ ｄ ｔｃｉ ｇ Ｗ Ｓ Ｖ ｎ Ｐ．ｃａ ｋｉｏ ａｇ ｃ ｌ ． ｏ ｌ ｅ ａ ｌｅ ａ ｉ ｌ ｅｅ ｔｎ Ｓ ｉ ｏ ｌ ｒ ｉ ｎ ａ ｌｒ ｅ ｓ ａ ｅ
ｆｅ ｚ ｄ—ｈａ ｄ ３ ｔｍｅ ｎ ｈ ｎ ｄ ｆｅｅ ｉｌｃ ｎ ｒｆ ｇ ｔｄ． Ｔｈ ｅ ｌｔｗａ ｕ ｐ ｎ ｅ ｎｄ ｄ ｇ ｓｅ ｔ ０ Ｌ ｐｒｔｉ ａ ｅ Ｋ ｅ ｅ ｔ ｗｅ ｉ ｓ ａ ｄ ｔ ｅ ｉｆ ｒｎｔ ｅ ｔｉｕ ａｅ ａ ｅ ｐ ｌｅ ｓ ｓ ｓ ｅ ｄ ｄ ａ ｉ ｅ ｔｄ ｗｉｈ ５ ｏ ｅｎ ｓ
的症状 。
１ ２ １ 病 虾肝胰 腺 中 ＷＳ Ｖ Ｄ Ａ模 板 的制备 ． ． Ｓ Ｎ
本实 验 对 传 统 的病 毒 Ｄ Ａ 模 板 制 备 方 法 Ｎ
加 以改进 ：取 整 只病虾 肝胰 腺 于玻璃 匀浆 器 中 ，加 入 Ｄ Ｂ Ｌ Ｐ Ｓ７ ｍ ，冰 浴 中匀 浆 ，收 集 匀 浆 液 冻 融 ３ 次 ，４ ０ ／ ｉ ，４ ｏ 心 ３ ｉ ，用 注射 器 取 上 ０ ０ ｒｍ ｎ Ｃ离 ０ｍｎ 清 （ 搅动 上层 油脂 ） 勿 ，于新 离心 管 中 １０ ０ｒｍ ｎ ５０ ｉ， ／ ４℃ 离心 ２ｈ ，沉淀 用 ５ Ｌ蛋 白酶 Ｋ溶 液 （ ０ｍＭ ０ ５
高速离心 ５ｒ ｎ即可取上清液用于 Ｐ Ｒ扩增 ，结果显示 ：与传统 的病毒模板 Ｄ Ａ提取 方法相 比，本方法 的 Ｐ Ｒ ｉ ａ Ｃ Ｎ Ｃ 结果特异性强 ，扩增效率高 ，准确率 高 ，可应用于快速大规模检测克氏原鳌 虾中的 ＷＳ Ｖ。 Ｓ
关 键 词 ：克 氏 原螫 虾 （ ｒ ａ ｂｒｓｃ ｒｉ ； 白斑 综合 征病 毒 （ Ｓ ；肝 胰 腺 ；Ｐ Ｒ检 测 Ｐｏ ｍ ａｕ ｌ ｋｉ ｃ ａ ） ＷＳ Ｖ） Ｃ
ＷＳ Ｖ） Ｓ 是迄 今 为止危 害 最 为严 重 的一 种对 虾 病毒 。
本引 入我 国。经过 几十 年的扩 散 ，已形 成 全 国性 的 分布 ，成 为常 见 的淡 水 经 济 虾 类 。近 年 来 国 内
对虾 白斑综 合 征 自 １９ ９ ２年 暴 发 以来 ，己在 世 界 范 围内传播 开来 ，每年 给对虾 养殖业 造成 巨大经济损 失 ，至今 仍未得 到完 全控制 ，成为 目前对 虾养殖业
快速 检测 克 氏原螯 虾 ＷＳ Ｖ 的 Ｐ Ｒ方法 。 Ｓ Ｃ
０ ５ｍ ／ Ｋ） ． ｇ ｍＬＰ 悬浮 ，室温 消化 ５ｍｉ ，１０℃沸 水 ｎ ０ 浴 １ ｉ ，１０ ０ｒ ｒ ｎ离 心 ５ ｍｉ ，取 ３ Ｌ上 清 ０ｍ ｎ ０ ０ ／ ｉ ａ ｎ 用 于 Ｐ Ｒ检 测 。同 时 取健 康 无 病 的 克 氏原 鳌 虾 肝 Ｃ 胰腺 作 阴性 对照 ，作 相 同处理 。 １ ２ ２ ＷＳ Ｖ的常规 Ｐ Ｒ和巢式 Ｐ Ｒ检 测 ．． Ｓ Ｃ Ｃ 参 照世 界动 物卫 生组 织 （ Ｉ 检 测 ＷＳ Ｖ 的标 Ｏ Ｅ） Ｓ
克 氏原螫 虾 （ ｒｃｍｂｒｓｃ ｒ ｉ属 于 甲壳纲 十 Ｐ ｏａ ａｕ ｌ ｋ ） ａ ｉ 足 目鳌虾科原 鳌虾 属 ，俗 称小 龙虾 。克 氏原 螫虾 原
产于 北美 ，后 传入 日本 ，２ ０世纪 ２ 、３ ０ ０年代 经 日
毒病 的暴发 。 白斑 综 合 征 病 毒 （ ｈｔ ｓｏ ｓｎ ｒｍ ｉ ｓ ｗ ｉ ｐ ｔ ｙ ｄｏ ｅ ｖ ｕ ， ｅ ｒ
徐 进 ，范玉顶 ，周 令兵 勇 ，曾
（ ．中国水产科 学研 究院长 江水产研 究所 ，荆 州 ４ ４ ０ ； １ １ ３０ ０
２ ．华 中农业 大 学水产 学院 ，武 汉 ４ ０ ７ ） ３ ０ ０
摘 要 ：对 传 统 对 虾 ｒ斑 综 合 征病 毒 （ Ｓ 的 Ｐ Ｒ检 测方 法 中 的病 毒模 板 Ｄ Ａ 的提 取 方 法 加 以改 进 ，建 立 了 一 ｛ ＷＳ Ｖ） Ｃ Ｎ 种 快 速检 测 克 氏原 螯 虾 （ ｒｃｍ ａｕ ｌ ｋ ） Ｓ Ｐｏａ ｂｒｓ ａ ｉ ＷＳ Ｖ的 Ｐ Ｒ方 法 。本 方法 将 克 氏原 螯 虾 肝 胰 腺 组 织 匀 浆液 冻 融 ３次 ｃ ｒｉ Ｃ 进 行 差速 离 心 后 ，存 病 毒 沉 淀 中 加 入 ５ Ｌ蛋 白酶 Ｋ溶 液 ，室 温 消 化 ５ ｍｎ ０ ｉ，沸 水 中 煮 １ ｉ ，１００ ｒｍ ｎ ０ｒ ｎ后 ａ ００ ／ ｉ
ＫＣ１ １ Ｍ ｉ— ， ５ｍ Ｔｒｓ ＨＣ１ｐ ８ ３， ０． Ｈ ． ５％ Ｎｏ ｄｅ ４ ， ｎｉ ｔＰ ０
聚 合 酶 链 式 反 应 （ ｏ ｍ ｒｓ ｈｉ ｒａｔｎ ｐｌ ｅａｅｃａｎ ｅｃｉ ， ｙ ｏ Ｐ Ｒ） 有快 速 、敏 感 、特 异 性 强 等 特 点 ， 目前 已 Ｃ 具
准 中所 用 引 物 序 列 ，外 引 物 Ｐ ：Ｆ ：５一Ｃ １ １ Ａ Ｔ
消 费以及 出 口的增 长 ，大大刺 激 了克氏原 螯虾养 殖 业 的发展 。高密度 的集 约化养 殖导致 克 氏原螯 虾病
可持 续发 展 的 主要 障 碍 之 一 Ｌ 。雷 质 文 等 和 王
收 稿 日期 ：２ ０ ０ ８—０ ２ ８— ５
资 助 项 目 ：湖 北 省 财 政厅 应 急 攻 关 项 目 第 一 作者 简 介 ：徐 进 （９ ２一 ） 男 ， 族 ， 士研 究 生 ， 究 实 习 员 ， 从 事 水 生 动 物病 害与 防 治 方 面 的研 究 。 １８ ， 汉 硕 研 现
Ｋ ｙ ｗ ｒ ｓ ｒｃ Ｉ ａｕ ｃ ｒｉ；ｗ ｉ ｐ ｔ ｙ ｄｏ ｍ ｖｒｓ ＷＳ Ｖ） ｅ ａ ｐ ｎ ｒａ ；Ｐ Ｒ ｄ ｔｃ ｏ ｅ ｏ ｄ ：Ｐ ｏａｎ ｒｓ ｌ ｋｉ ｈｔ ｓｏ ｓｎ ｒｎ ｉ （ Ｓ ；ｈ ｐ ｔ ａ ｃｅ ｓ Ｃ ｅ ｔ ｎ ｂ ａ ｅ ｕ ｏ ｅｉ
Ｆｓｅ ｅ Ｃ ｌｇ ｕｚｏｇＡ ｒ ｕｔ ａ ｎｖ ｓｙ ｉ ｒｓ ｏｅｅｆＨ ａｈｎ ｇｉ ｌ ｒｌ ｉ ｒ ｔ，Ｗｕａ ４０ ７ ） ｈ ｉ ｌ ｏ ｃ ｕ Ｕ ｅｉ ｈ ｎ ３ ００
Ａｂｓｒ ｃ ｔ ａ ｔ： Ａ ａ ｉ ｒ ｐ ｄ ＰＣＲ ｔ ｏ ｓ ｅ ｔｂ ｉｈ ｄ ｆ ｒｄｅｅ ｔｎｇ Ｗ Ｓ ｍｅ ｈ ｄ ｗａ ｓａ ｌｓ ｅ ｏ ｔｃｉ ＳＶ ｆＰｒｃ ｍ ｂ ｕ ｌ ｋ ｉｂ ｓ ｄ ｏ ｈ ｍ ｐ ｏ ｅ ｎ ｆ ｏ ０ ａ ａｒ ｓｃａｒｉ ａ ｅ ｎ ｔｅ ｉ ｒ ｖ ｍｅ ｔｏ
然界 能感 染 ＷＳ Ｖ，患 病虾 有 较 高 的死 亡 率 。患 病 Ｓ 克 氏原鳌 虾活 动迟 缓 、不摄 食 、稍 卷尾 ，感 染 晚期 活动 呆 滞 ，进 一 步 卷 尾 ，濒 死 时 腹 部 向上 形 似 死 亡 ，头胸 甲壳 易 剥 离 ，但 未 见 白斑 。２ ０ ０ ８年 湖 北荆州 市各 克 氏原螯 虾养 殖 池一 些病 虾也 具 有相 同
中图 分 类 号 ：￥４ ．９ ９５ ４ ９ ５ １ ；￥ ４ ．９ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１０ —９７ （０ ８ ０ ４ ５ ４３ ０ ０６０ 一２ ０ ）６ ） ２ ） ０
ＰＣＲ ｎ ｓｅ ａ ｄ Ｎｅ ｔ ｄ ＰＣＲ ｅ ｈ ｄ ｆ ｒ Ｄｅ ｅ ｔｎｇ Ｗ ＳＳ Ｍ ｔ ｏ ｏ ｔｃ ｉ Ｖ ｉ Ｄ ａ ａ ｕ ｌｒ ｉ ｎ Ｐｒ ｃ ｍｂ ｒ ｓ ｃａ ｋ ａ
被 广泛 应用 于病 毒 检 测 中 。巢 式 Ｐ Ｒ法 是 指 利 用 Ｃ 两 套 Ｐ Ｒ引物 （ 式引 物 ） 进行 两 轮 Ｐ Ｒ扩增 反 Ｃ 巢 对 Ｃ 应 。首 先用 一对 外 引物进 行第 １ Ｐ Ｒ，然后 再使 轮 Ｃ 用 第 １对 引物 扩增 的 Ｄ Ａ序 列 内部 的一 对 引物 再 Ｎ 次 扩增 。模 板 Ｄ Ａ 制备 方 法对 整 个 检 测 方 法 的好 Ｎ 坏起 决定 性作 用 。本 实验 将 传统 的检 测 对 虾 ＷＳ Ｖ Ｓ 的 Ｐ Ｒ检测 方 法 Ｃ 中 的模 板 Ｄ Ａ 制 备 方 法 加 以 Ｎ 改进 ，以采集 自荆 州地 区患病 克 氏原螯 虾肝 胰腺 为 实验 材 料 快 速 制 备 ＷＳ Ｖ模 板 Ｄ Ａ，建 立 了一 种 Ｓ Ｎ
ｓ ｌ ｔ ｎ ａ ｄ ｄｇ ｓｅ ｒ ｎ ａ ｒｏ ｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ ． Ｔ ｅ ｌ ｓ ｔ ｗ ｓｂ ｉ ｄ ｆ ｒ１ ｉ ｎ ｈ ｎ ｃ ｎｒ ｕ ｅ ｔ ０ ０ ／ ｎ ｏｕ ｉ ｎ ｉｅ ｔ ｄ ｆ ｍｉ ｔ ｏ ｍ ｅ ｅ ａｕ ｅ ｏ ｏ ５ ｈ ａｅ ａ ｏｌ ０ ｒ ｎ ａ ｄ ｔ ｅ ｅ ｔ ｆ ｇ ｄ ａ ０ ０ ｒ ｍｉ ｙ ｅ ｏ ａ ｉ １ ｏ ｎｉ ｂ ｆ ｒ ｓ ｄ ｆ ＣＲ ａ ｌ ａ ｉ ． ｈ ｅ ｕ ｔ ｉｄ ｃ ｔｄ ｔ ａ ，ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉ ｔ ｅ ｔ ｉ ｏ ａ ｉ ｅ ｌｔ ＮＡ ｆ ｒ ｌ ｅｏ ｅ ｕ ｅ ｒＰ ｍｐｉ ｃ ｔ ｎ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｎ ｉａｅ ｈ ｔ ｏ ａｅ ｔ ｈ ｒ ｄ ｔ ｎ ｌｖｒ ｓｔ ｍｐ ａｅ Ｄ ５ ｎ ｏ ｉ ｆ ｏ ｓ ｈ ａ ｉ ｅ
ｔ ｅ ｔ ｄ ｔ ｎ ｌＶ ｒ ｓｔｍｐ ａｅ ＤＮ ｅ ｔ ｃｉｎ ｏ ＣＲ ｍｅｈ ｄ Ｔ ｅ ｈ ｐ ｔｐ ｎ ｒ ａ ｆ ． ｌ ｒ ｉ ｗａ ｏ ｇ ｎ ｔｄ ｏ ｅａ ｄ ｈ ｒ ｉ ｏ ａ ｉ ａ ｉ ｕ ｅ ｌｔ Ａ ｘｒ ｔｏ ｆ ａ Ｐ ｔ ｏ ． ｈ ｅ ａｏ ａ ｅｅ ｓｏ ｃａ ｋｉ ｓｈ ｍｏ ｅ ａｅ ｎ ｉ ｎ Ｐ ｃ
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