人类外周血培养及染色体核型分析

人类外周血培养及染色体核型分析

一、实验目的：

1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；

2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；

3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。

二、实验原理：

1、植物血凝素的作用

外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。

2、秋水仙素的作用：

秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。

使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。

3、低渗的原理：

徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。

这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。

4、核型和带型：

核型(karyotype)：

是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。

在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。

将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。

带型（banding pattern）

即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。

常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。

三、实验用具及试剂：

1.实验仪器及用具：

恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；

培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。

2. 实验试剂：

外周血淋巴细胞培养基

2%碘酒

75%酒精

20µg/ml秋水仙素

0.075 mol/L KCl溶液

甲醇

冰醋酸

Giemsa原液

1/15 mol/L磷酸缓冲液

四、实验步骤：

1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约0.5 ml。

2、种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接25－28滴（约0.5ml），轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养72小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。

3、秋水仙素处理：在终止培养前4小时，向培养瓶中加20µg/ml的秋水仙素20µl，轻轻摇匀后继续培养到72小时。

4、制片：

（1）离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/分，离心10分钟。

（2）低渗：弃去上清液。加入37℃预热的

0.075mol/L KCl低渗液6-8ml，用吸管轻轻吹打均匀，放在37℃恒温水浴中30分钟。(此时配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml )

（3）预固定：在离心管中加入现配的预温的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约1ml，轻轻混匀, 37℃固定15分钟。

（4）再次离心：2000转/分离心10分钟。

（5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约7ml，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定20分钟。2000转/分离心10分钟。

（6）第二次固定：同第一次固定。

（7）弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固定液6～8滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。

（8）滴片：在10-15cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。

（9）染色：用10%吉姆萨染液扣染30分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。

（10）照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核型)，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。

（11）核型分析：应用核型分析软件，进行染色体核型分析。

五、注意事项:

1、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

2、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。

3、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。

4、固定液应在使用前临时配制。

5、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。

六、实验结果与分析：

染色体核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。

（1）人类染色体分组

A组（No.1～3）：是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色体；

B组（N0.4～5）：为两对大的亚中部着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；

C组（N0.6～12+X）：为中等大小的亚中部着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；

D组（N0.13～15）：为中等大小的近端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；

E组（N0.16～18）：包括一对中着丝粒染色体（16）和两对亚中着丝粒染色体（17、18）；F组（N0.19～20）：为两对小的中部着丝粒染色体；

G组（N0.21～22+Y）：为最小的一组近端着丝粒染色体，在N0.21～22的短臂上可见随体。Y染色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。

（2）人类染色体核型分析结果

（1）染色体的相对长度=单个染色体长度*1000/22条常染色体总长+1条X染色体长度（2）臂比率=长臂长度/短臂长度

（3）着丝点指数=短臂长度*100/染色体全长

七、作业及思考题：

1、将分散良好的标本进行显微照相；

2、观察人类染色体的形态、结构特点；

答：A组（No.1～3）：是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色体；

B组（N0.4～5）：为两对大的亚中部着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；

C组（N0.6～12+X）：为中等大小的亚中部着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；

D组（N0.13～15）：为中等大小的近端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；

E组（N0.16～18）：包括一对中着丝粒染色体（16）和两对亚中着丝粒染色体（17、18）；F组（N0.19～20）：为两对小的中部着丝粒染色体；

G组（N0.21～22+Y）：为最小的一组近端着丝粒染色体，在N0.21～22的短臂上可见随体。Y染色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。

3、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；

答：相同点：每个细胞都有46条染色体，22对常染色体和1对性染色体。

不同点：男性为46，XY；女性为46，XX。Y染色体常呈现异固缩状态，着色更深；X染色体为中等大小的亚中部着丝粒染色体

4、总结做好本实验的关键因素。

答：本实验关键是标本片子中的染色体分散良好，结构明显，易于区别，所以应注意：

1）使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。秋水仙素处理细胞时，时间应控制适当，时间过长，分裂细胞多，染色体短小，反之，细胞分裂想少，染色体细长，都不利于观察和分析。

2）低渗处理时时间要适当，且混匀细胞时一定动作要柔和，否则，细胞膜破裂，染色体丢失。

3）离心前要配平，离心速度合适，过高则细胞不易打散，过低细胞易丢失。

4）固定液应在使用前临时配制。

5）在10-15cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。6）照相前要认真镜检，做好标记。