改善反向液相色谱峰拖尾的方法()

改善反相HPLC中的峰拖尾

分离碱性化合物、通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾

峰拖尾可以引起分离度降低、灵敏度减弱、精密度和定量变差。（峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关；准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响）

峰拖尾原因及解决方案

相引起的拖尾

现象：

1、先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；

2、进样量减少或样品经流动相稀释后进样峰拖尾情况减轻。

二、由样品量（进样量超过柱子容量）过载引起的峰拖尾

现象：

1、样品峰呈现直角三角形，当更多的样品量注入时，峰前端变尖、后端拖尾更严重。

2、色谱柱过载后，保留时间随样品量的增加而提前。（见图3）

表

最大进样量、进样量的范围

因为实际进样量依赖于柱子的填料（具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量），分析物质（分子量大的进样量要少），和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。

图3 样品量过载引起的拖尾

表3 反相HPLC常用缓冲液

三、固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾

原因：带正电荷的溶液（胺类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换，引起二次保留(图 4)，常见于固定相具有显着的硅醇活性的的色谱柱，中性pH（6～8）条件下比酸性pH（<3）更易发生。酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应的影响。

解决：

1、确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件下操作（使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少溶质与硅醇反应的几率）。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。

在pH<3的条件下操作，可减少由

图4相互作用引起的峰拖尾，原理：

? 固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点，经反相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。

2、在流动相中加入竞争性的胺类，如：在流动相中加入三乙胺（TEA）（多数情况下，约10mM即可）。TEA可以与硅醇发生强的反应，并抑制样品中的胺类与硅醇反应。

如图5：向流动相中加入TEA用来提高峰形

1.苯丙醇胺

2.麻黄碱

3.苯丙胺

4.甲基

苯丙胺5.?苯三胺

色谱柱：Eclipse XDB-C8，

4.6*150mm

流动相：85%25mMNa2HPO4，pH7.0，15%ACN

流速：1.0ml/min

温度：35℃

样品：苯丙胺类

缺点：此法增加了分析方法复杂性并且改变色谱柱性质不易逆转。强度胺类（如三乙胺），不易从色谱柱上洗脱下来。既用过含有TEA的色谱柱就不再适合应用于流动相中不含TEA的分析。

原理：三乙胺与硅醇强烈作用，减少了样品混合物中胺类与硅醇的作用，因此，使用三乙胺可以不用选择低硅醇活性的固定相。

反相HPLC色谱柱检测固定相硅醇活性的方法：根据阿米替林的对称性（峰拖尾），柱子对称性低则硅醇活性低。阿米替林在固定相中拖尾较低（对称值低），则固定相硅醇活性较低，并且检测碱性化合物时就会有较低的拖尾。图6根据测定阿米替林的对称性（即硅醇活性）排列了常用的C18反相色谱柱

色谱柱：4.6×150mm，5um

流动相：80%甲醇；20%0.05M磷酸盐缓冲液pH7

流速：2.0ml/min

温度：24℃

样品：阿米替林

四、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾

原因：硅胶固定相的吸附。

解决：提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应，降低流动相的pH使硅醇和溶质质子化，必要时可以向流动相中加入竞争性的酸（如图）。

色谱柱：4.6×150mm，C18

流动相：40%5mMNaH2PO460ACN

样品：布洛芬（酸性化合物，严重拖尾，向流动相中加入乙酸可以改善。乙酸优先和硅胶固定相表面的酸性硅

醇基反应，抑制了布洛芬和硅醇基的反应，减低了拖尾。）

五、柱床空隙引起的拖尾

随填装技术完善，柱头空隙越发少见，除非在极高的压力或流速的条件下装柱时可能出现。

现象：平时色谱柱柱效良好，突然性发现所有的峰均拖尾时；

先洗脱出的峰较后洗脱的峰更易受柱空隙的影响。

解决：更换柱子。