HPLC实验步骤和方法开发解析

在兽药研究中分析应用
HPLC 的应用领域
在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)
在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析
表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
二.方法开发的过程
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的确认
Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2
理想的HPLC检测器
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感
长时间操作的稳定性
低死体积
非破坏性
选择性
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音 的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10
液相色谱的应用以及方法开发
提纲：
一.HPLC的广泛应用 二.方法开发过程 一）选择HPLC检测器 二）分配色谱及选择流动相
三）方法开发的具体步骤
四）梯度洗脱方法
一.HPLC的广泛应用
据2004年统计，世界上化合物总数多 达4700多万种 在全部有机化合物中仅有20％左右的 样品适用于GC分析 而HPLC可对80％左右的有机化合物进 行分离和分析
HPLC的广泛应用
HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极 性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质 的分离和分析并且可以做制备 在医药、食品、农业、生命科学、化工、 环保等领域都有着广泛的应用潜力。
HPLC的应用领域
在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
碳水化合物 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 脂肪酸和有机酸 蛋白、肽、氨基酸
HPLC的应用领域
化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等； 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等 在环境污染分析中的应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚 类和胺类的检测 在无机离子分析中应用 –饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
6:1
好的信噪比有利于：
更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性
S
N
选择液相色谱的检测器
要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）
梯度wenku.baidu.com是等度
灵敏度需求
是否有双检测的需求
选择液相色谱的检测器
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 RI ug 104 是 是 否 ABS ng 105 否 否 否 ELSD ng 否 否 否 是 FL pg 103 否 否 否 MS pg 103 是 否 是 EC fg 106 是 是 是 Cond pg 105 是 是 否 MS pg 103 是 是 是
并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响，检测器的表现可 能与其最佳水平有较大的差距
用于HPLC的检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相 色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型）
对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流 动相的变化（选择型）
整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变 化作出响应（通用型）
第一步干什么?
想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样 品的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---
仪器制造商的文献，如Dionex,Waters
对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求?
注意色谱柱的规格：内径、柱长
需要调整流速、进样量
注意梯度条件
了解系统的滞后体积（梯度）
一）选择HPLC检测器
对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性 关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是：
由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与 浓度之间关系的与线性偏离现象
是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
分离(制备)时要了解哪方面的情况？
要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高?
纯度或活性的鉴定如何完成?
使用文献方法注意点
色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相
食品添加剂
酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料（色素〕 维生素
污染物
霉菌（黄曲霉毒素〕 农药残留和兽药残留 多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸
HPLC的应用领域
在医药研究中分析应用
药物分析有USP、BP、CP等标准
常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血 管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激 素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、 四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙 等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺 毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。