实验六、农杆菌介导转化拟南芥
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科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5 月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生 物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原 因主要基于这种植物具有以下特点：
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
•
另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在
T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做好 标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中， 并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后， 将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足 horgland营养液，恢复正常培养。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
实验目的：学习真核生物的转基因技术及农杆菌介 导的转化原理。
•实验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法， 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 技术应用：一种方便，高效的植物转基因方 法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也 逐渐用于单子叶植物的转化。
• 实验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 表达载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
• （4）拟南芥是自花授粉植物，易于获 得纯合突变体。
• 1.2 拟南芥的培养：
• 将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种 于MS培养基上，于22℃、光照10h培养12周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1） 混合物上培养。
• 注意： 湿度要大一些。
2.转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛， 在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
• 试剂： YEB液体培养基，Kan（卡那霉素）， Rif（利福平）；
转化介质 ：1/2 MS大量，1×铁盐，1×微量， 1×有机，5%蔗糖， 0.01µg/ml 苄氨基嘌呤 (BAP)，0.03%silwetL-77，20 mg/L乙酰丁香酮， KOH调pH值至5.7。
1 拟南芥
1.1 简介： 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花
Hyg基因或Lac Z基因等。
双元载体系统的转化原理是Ti质粒上 的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
外外源源基基因因 切
3 转化方法
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质 体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。
• 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得 到广泛应用。
实验流程
1. 挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌GV3101菌 株至5ml 新鲜YEB液体培养基（50g/ml Kan，125g/ml Rif）中，28℃摇培24h。
• 2.2 根癌农杆菌含有 Ti (tumor-inducing plasmid)质粒，Ti 质粒上的 T-DNA （transferred DNA）在 Vir区（virulence region）基因产物的介导下可以插入到植物基因组 中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将 外源目的基因插入到 T-DNA 中，借助 Ti 质粒 的功能，使目的基因转移进宿主植物中并进一步 整合、表达。
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
•
另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在
T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做好 标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中， 并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后， 将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足 horgland营养液，恢复正常培养。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
实验目的：学习真核生物的转基因技术及农杆菌介 导的转化原理。
•实验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法， 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 技术应用：一种方便，高效的植物转基因方 法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也 逐渐用于单子叶植物的转化。
• 实验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 表达载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
• （4）拟南芥是自花授粉植物，易于获 得纯合突变体。
• 1.2 拟南芥的培养：
• 将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种 于MS培养基上，于22℃、光照10h培养12周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1） 混合物上培养。
• 注意： 湿度要大一些。
2.转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛， 在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
• 试剂： YEB液体培养基，Kan（卡那霉素）， Rif（利福平）；
转化介质 ：1/2 MS大量，1×铁盐，1×微量， 1×有机，5%蔗糖， 0.01µg/ml 苄氨基嘌呤 (BAP)，0.03%silwetL-77，20 mg/L乙酰丁香酮， KOH调pH值至5.7。
1 拟南芥
1.1 简介： 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花
Hyg基因或Lac Z基因等。
双元载体系统的转化原理是Ti质粒上 的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
外外源源基基因因 切
3 转化方法
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质 体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。
• 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得 到广泛应用。
实验流程
1. 挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌GV3101菌 株至5ml 新鲜YEB液体培养基（50g/ml Kan，125g/ml Rif）中，28℃摇培24h。
• 2.2 根癌农杆菌含有 Ti (tumor-inducing plasmid)质粒，Ti 质粒上的 T-DNA （transferred DNA）在 Vir区（virulence region）基因产物的介导下可以插入到植物基因组 中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将 外源目的基因插入到 T-DNA 中，借助 Ti 质粒 的功能，使目的基因转移进宿主植物中并进一步 整合、表达。