实验六、农杆菌介导转化拟南芥
农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的
第32卷第2期2013年2月绵阳师范学院学报Journal of Mianyang Normal University Vol．32No．2Feb．，2013收稿日期：2012-12-30基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009－091B ），国家自然科学基金（30871555），教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET －08－0940），四川省教育厅（09ZA034）、西南科技大学博士研究基金（11zx7104）和农业部公益性行业科研专项（201103007）作者简介：张思维，硕士研究生，主要从事植物遗传与抗逆研究*通讯作者：代其林，博士，副教授，研究方向为植物遗传与抗逆研究．E －mail ：daiqilinmj@．sina．com农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究张思维，周文波，张新，陈翠娜，代其林*（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621000）摘要：耐辐射奇球菌(D．radiodurans ，DR )在极端胁迫条件下能够继续生存，其耐辐射奇球菌基因组中(DRR1)拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛研究．DR 1372基因就是在DR R1中克隆得到的一个基因，其蛋白序列存在一个Why 功能域，此功能域可能参与了植物的抗旱过程．我们利用基因工程手段首先构建了植物DR1372－GV3103表达载体，然后利用花序浸染法成功将目的基因DR 1372转入拟南芥中，最后对阳性植株进行盐胁迫，证实了DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．初步建立了农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥体系，为后续DR 1372基因的功能研究工作提供了理论基础．关键词：DR 1372;载体构建;盐胁迫;拟南芥中图分类号：O175.12文献标识码：A 文章编号：1672-612x （2013）02-0057-080引言目前，越来越多的抗旱相关基因已经被克隆，并用来提高植物的抗旱性．按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相关基因分为两大类：第一类是编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质基因，属于功能基因；第二类是编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的转录因子基因，属于调节基因［1］．Pibn －Smits 等将otsA 和otsB 导入烟草，在干旱胁迫下，转基因植株中海藻糖含量比对照高，叶面积增大，光合活性提高［2］．Kishor 等将从乌头叶豇豆中克隆的P5CS 基因与CaMV35S 启动子连接转入烟草中，发现转基因烟草的脯氨酸含量比对照高10－18倍；干旱胁迫下，转基因烟草落叶少而迟，根比对照长40%，生物量增加2倍［3］．Capell 等发现Adc 在水稻中的超表达缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失，并提高了水稻的抗旱性［4］．由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达，所以转化调节基因能有效地提高植物的耐旱性，与抗旱相关的转录因子有DREB 、MYC /MYB 、bZIP 、WRKY 和NAC 类等，其中MYB /MYC 是植物中最大的转录因子家族．Chen 等发现了小麦中23个MYB 转录因子，其中有4个与抗旱相关［5］．耐辐射奇球菌（D．radiodurans ，DR ）是Anderson 等科学家在1956年从经过灭菌处理的肉类中发现的一种红色非致病性球菌，目前被认为是"世界上抗性最强的细菌"，因其对电离辐射、干燥、紫外线及一些DNA 损伤试剂显示超强的抗性，一直倍受生物医学界的关注［6］．White 等在1999年公布了DR R1的完全基因组序列，包括两条染色体，共携带有3195个可预测基因，并对部分基因进行了评注［7］．DR R1基因组可以在一个细胞中完成DNA 修复，DNA 损伤信号输出，干旱和饥饿胁迫的应答，以及基因组的修复等功能．Battista 等推测，在耐辐射球菌R1中的抗旱性研究将用于引导较高生物体的抗旱性研究［8］．DR1372基因是耐辐射奇球菌体内1号染色体上的一个基因，把这个基因转入大肠杆菌后进行培养，经初步定性分析发现，在大肠杆菌中有稳定细胞膜，调节细胞内外渗透压的作用，初步推测为与调节水分胁迫应答有关的基因．对DR1372蛋白序列进行分析发现，其内部存在一个WHy 功能域非特异性结合位点，与HIN1蛋白中的WHy 功能域结构非常相似［9］．WHy 结构域存在于几大类蛋白质家族中，大约由100个氨基酸组成，这些氨基酸由亲水性和疏水性氨基酸交替排列，并且在N 末端都存在一个非蛋白氮（NPN ）结构．同时，研究者还在胚胎发育晚期蛋白中也发现了WHy 功能域的存在，最终推测WHy 结构域是参与植物水分胁迫应答以及超敏应答的一类功能域［9］．脱水素是一类亲水性蛋白质，其蛋白结构中也含有一个WHy 功能域，它们在胚胎发生后期阶段产生，对低温、外源ABA 、干旱、盐渍以及脱水胁迫反应迅速，进而在植株中积累［10、11］．由于WHy 功能域参与了干旱胁迫应答，这些间接证据表明DR 1372基因在干旱胁迫过程中也可能参与了抗旱性相关的基因．因此，本研究利用基因工程手段构建植物DR 1372－GV3103表达载体，将DR 1372基因转入拟南芥中，得到转基因抗性拟南芥，并对转DR 1372基因拟南芥幼苗进行了盐胁迫的反应，不仅为后续的该基因研究提供了丰富的植物材料，也为DR 1372的功能研究包括WHy 功能域的功能研究奠定了基础，对植物育种工作也有一定的指导意义．1实验材料1．1植物材料拟南芥野生型col －0生态型1．2菌株DR 1372+Z3（DR 菌内与干旱相关的基因DR 1372与穿梭质粒pRADZ3连接转大肠杆菌），JM109，JM109，GV31032实验方法2．1构建DR 1372－GV3103植物表达载体2．1．1DR 1372基因的引物设计根据DR 1372基因序列，利用生物软件Primer5设计出该基因的上、下游引物（分别命名为DR 1372－F ，DR 1372－R ）；根据pBI121质粒图谱，分别引入XbaI ，SacI 限制性酶切位点，并设计引物如下：Sence ：5＇－－－－－－GC TCTAGA ATGAAGAAGATGGCTTTTGCG －－－－－3＇Antisence ：5＇－－－CG AGCTC TCAAAACACCGATAAAGGCGC －－－－3＇（加粗标记示酶切位点）2．1．2PCR 扩增目的基因DR 1372用试剂盒（TIANGEN ）提取DR 1372+Z3质粒，在最优扩增体系下进行PCR 扩增．电泳验证．2．1．3质粒pBI121的提取用试剂盒（TIANGEN ）提取pBI121质粒．电泳验证．2．1．4PCR 产物胶回收PCR 产物经电泳检测后，使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（TIANGEN ）回收扩增的目的片段DR1372和pBI121．电泳验证．2．1．5DR 1372基因和pBI121的酶切，连接，筛选及鉴定2．1．5．1目的片段DR 1372和pBI121质粒用XbaI ，SacI （购自Takara 公司）进行双酶切，37ħ酶切过夜，回收目的片段．2．1．5．2将回收的目的基因片段和pBI121质粒大骨架片段，16ħ连接过夜，重组质粒转化JM109感受态细胞．2．1．5．3阳性克隆检测：进行菌落PCR 初步鉴定，将PCR 检测出的阳性单克隆摇菌后送华大基因公司测序．2．1．6挑取测序成功的JM109单菌落，继代培养，保菌．将保存菌种摇菌提取质粒，得到DR 1372－GV3103植物表达载体．2．2花序浸染法转化拟南芥2．2．1培养基：MS 培养基中抗性筛选平板加入卡拉霉素（Kan ，50mg /ml ）Hoagland＇s （霍格兰氏）液体培养基药品试剂：乙酰丁香酮（AS ）Silwet －L77表面活性剂2．2．2拟南芥种子的消毒、铺板及植株培养选取150粒拟南芥种子，用75%乙醇消毒1min ，然后用无菌水洗2遍；再用2．5%NaClO 消毒5min ，用无菌水清洗5遍后，最后用加无菌水少许，放在4ħ冰箱春化2d 后进行铺板．·85·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）铺板前一天按照每板大约25mL MS 配制固体平板培养基，col －0生态型拟南芥种子铺于无抗性培养基上，放入光照培养箱中（22ħ，16h /8h 光/暗培养（光强130μmol ·m －2·s －1））．培养10d 后把拟南芥幼苗移栽至培养土中（营养土/蛭石=2：1），相同温度和光照条件下继续培养，每3d 浇水一次．待拟南芥开出花序准备进行浸染．2．2．3花序浸染法浸染拟南芥：2．2．3．1DR 1372－GV3103农杆菌的培养：在200mL LB 液体培养基中加入0．2mL DR 1372－GV3103菌液，28ħ220rpm 振荡培养15h 左右，室温下4000rpm 离心20min ，弃上清，用1/2MS 液体培养基（含AS 100μmol /L ，0．05%Silwet －L77表面活性剂）悬浮菌体，稀释到原体积的10倍，在28ħ220rpm 振荡培养1h ，菌液浓度达到OD 600=0．5时待用．2．2．3．2浸染：将拟南芥未开花的花序浸入菌液中3－5s ，倒放24h ，并用薄膜覆盖避光24h ，然后21ħ光照培养．2．2．4收取拟南芥的T 1代种子：T 1代种子采收后，用含有卡那霉素的平板进行转基因阳性筛选，然后提取抗卡那霉素的拟南芥幼苗基因组进行PCR 鉴定，阳性T 1代幼苗开花结实后，收取T 2代种子，得到纯合体转基因拟南芥种子．2．3转DR1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应2．3．1拟南芥种子的消毒、铺板选取T 2转基因拟南芥种子约200粒，用75﹪乙醇消毒1min ，用无菌水洗2遍；再用2．5﹪NaClO 消毒5min ，随后用无菌水清洗5遍，再次加入无菌水放置在4ħ冰箱进行春化处理2d．然后把春化后的种子铺在25mL MS 固体培养基上，转基因和非转基因拟南芥种子均铺于无卡拉霉素的培养基上，封口放入光照培养箱中培养（22ħ，16/8h 光/暗培养（光强为130μmol ·m －2·s －1））．2．3．2对拟南芥幼苗进行NaCl 盐胁迫待拟南芥幼苗在平板上长出3片叶后，在平板中加入0、100、200、250和300mmol /L 灭菌的NaCl 溶液．然后观察拟南芥幼苗的生长状况．3结果3．1pBI121－DR 1372质粒的构建3．1．1提取含DR 1372基因质粒提取DR 1372质粒，其电泳结果如图A 所示，我们提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以用于PCR 扩增．3．1．2DR 1372基因的扩增利用DR 1372－F 和DR 1372－R 引物对DR 1372基因进行PCR 扩增，其电泳结果如图B．DR 1372基因分子大小为495bp ，条带位置正确，并且为单一条带．然后对PCR 产物进行胶回收，其胶回收电泳结果如图C．3．1．3pBI121质粒的提取提取pBI121质粒后进行电泳，其电泳结果如图D 所示，所提取的目标基因条带清晰，无弥散现象，可以进行酶切．3．1．4对DR 1372胶回收产物进双酶切，酶切位点分别为XbaI ，SacI ，经电泳后（图E ）再胶回收（图F ）．同时对pBI121质粒进行XbaI ，SacI 双酶切，其电泳图和胶回收情况见图G 和图H．从图G 和图H 两个电泳图分析表明：经双酶切后，目的基因DR 1372和质粒pBI121都被切开，胶回收后都能够得到清晰单一的条带，该连接了DR 1372基因的质粒pBI121载体可以用于大肠杆菌和根癌农杆菌的转化．3．1．5连接目的基因的质粒转化菌种JM109把链接了目的基因的质粒转化到JM109后，经培养后挑取抗卡拉霉素菌落直接进行PCR 扩增，其扩增的部分结果如图I ，表明：有多个菌落显示为阳性，把阳性克隆送去测序，测序反馈结果经过软件分析，目的序列与DR 1372序列完全一致，说明DR 1372外源基因成功导入到了大肠杆菌中JM109．·95·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期图1pBI121－1372质粒的构建结果Fig．1pBI121－DR 1372clone in JM109A －I 中M 为DL2000MarkerA ：DR 1372+Z3质粒电泳条带A ：Agar gel electrophoresis of DR 1372B ：DR 1372扩增条带B ：Agar gel electrophoresis of PCR productC ：DR 1372PCR 胶回收验证C ：Agar gel electrophoresis of DNA extractionD ：pBI121质粒提取验证D ：Agar gel electrophoresis of pBI121E ：DR 1372双酶切电泳图E ：Agar gel electrophoresis of DR 1372digested productsF ：DR 1372双酶切后胶回收电泳图F ：Agar gel electrophoresis of DR 1372digested products ，extractionG ：pBI121双酶切电泳图G ：Agar gel electrophoresis of pBI121digested productsH ：pBI121双酶切胶回收验证H ：Agar gel electrophoresis of pBI121digested products ，extractionI ：JM109菌落PCR 验证I ：1：positive control ；2：negative control ；3－10：PCR products of JM109with pBI121－DR 1372clone3．2DR 1372－GV3103植物表达载体的构建将测序正确的JM109单菌落质粒转化GV3103感受态，得到的单菌落进行菌落PCR 验证，结果如图2．由图2可以选择1－2、4－6号保菌做浸染拟南芥用，阳性率为66．67%．图2DR1372－GV3103的菌落PCRFig．2Analysis of DR1372－GV3103M ：DL2000maker ，9：阳性对照，10：阴性对照，1－8：单克隆菌落PCRM ：DL2000Marker ；9：positive control ；10：negative control ；1－8：PCR products of GV3103with pBI121－DR 1372clone ·06·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）3．3转DR 1372基因拟南芥体系的建立及抗性植株的获得3．3．1转DR 1372基因拟南芥体系的建立利用花序浸染法侵染拟南芥未开花的花序，待拟南芥角果成熟后收取种子（浸染到收取种子的过程如图3所示）．将收取的种子用50mmol /L 卡那霉素筛选，得到30株抗卡拉霉素的幼苗，提取抗性幼苗DNA ，进行PCR 检测，然后得到10株转DR 1372基因的阳性拟南芥苗，待成熟后收种T 1代种子．对T 1代种子进行进一步筛选，得到纯合的转基因阳性植株T 2代，T 2代得到阳性苗60株，经PCR 检测后得到纯合阳性植株22株，阳性率为36．7%．3．3．2阳性植株的PCR 检测对具有卡那霉素抗性的转化植株提取DNA ，进行PCR 扩增和电泳检测，其电泳的部分结果如图4所示，共检测出12株拟南芥有清晰的495bp 大小的扩增条带，说明外源DR 1372基因成功转入到野生型拟南芥中．图3转DR1372基因拟南芥体系的建立Fig．3Regeneration of transgenic ArabidopsisA ：花序浸染后拟南芥B ：50MKan 筛选T 1代抗性苗C ：T 1带抗性拟南芥幼苗D ：T 1抗性拟南芥代成株子E ：筛选T 2代抗性苗F ：T 2代抗性拟南芥幼苗G ：T 2代抗性拟南芥成株A ：the impregnated ArabidopsisB ：resistant shoots of T 1generationC ：T 1generation Arabidopsis seedlingD ：the mature plant of T 1generationE ：resistant shoots of T 2generationF ：T 2generation Arabidopsis seedlingG ：the mature plant of T 2generation·16·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期图4转DR 1372基因拟南芥PCR 检测Fig．4PCR test of DR 1372gene in transgenic plantsM ：DL2000maker ；1：阳性对照；14：阴性对照（野生型）；2－13：抗性植株M ：maker ；1：positive control ；14：Negative controls （WT ）；2－13：Transformed plants3．4转DR 1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应当转DR 1372基因拟南芥T 2代和非转基因植株种子发芽生长至第3片叶时，分别添加0、100、200、250和300mmol /L 的NaCl 溶液．NaCl 胁迫7d 后，转DR 1372基因拟南芥植株与非转基因植株的生长发育状态发生了很大的变化，并且相同浓度下转基因植株与非转基因植株的萎蔫程度也有着明显的差别（如图5）．当NaCL 胁迫浓度为100mmol /L 时，非转基因植株叶片开始黄化，盐环境已经对拟南芥的生长产生抑制，而转基因植株未受影响；当NaCL 浓度达到200mmol /L 时，非转基因拟南芥的叶片和茎部黄化程度加重，植株开始萎蔫，同时转基因植株部分叶片也出现黄化；当NaCL 浓度达到250mmol /L 时，转基因拟南芥植株与非转基因植株都出现了不同程度的萎蔫死亡，但非转基因植株萎蔫程度要比转基因植株严重；当NaCL 浓度达到300mmol /L 时，非转基因拟南芥绝大部分萎蔫死亡，转基因植株虽然叶片和茎部出现萎蔫发紫，但死亡程度较小，部分植株仍能正常生长存活，说明转基因拟南芥有一定的抗盐能力，盐胁迫环境下下，DR 1372基因在一定程度上调控了植株度过盐环境．图5转DR 1372基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应Fig．5Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlingstreated with different concentrentions of NaCL·26·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）4讨论近几年许多与植物抗旱耐盐相关基因被克隆和分析，同时通过转基因技术将这些基因转入到植物中进行异源表达，能显著提高转基因植物的抗旱耐盐能力．其中转录因子通过与相关基因的特异性结合来调控其表达，进而产生相关调控蛋白等物质增强植物在逆境中的生存能力［12］．DR 1372基因的蛋白中有WHy结构域，这结构域是通过对HIN1蛋白进行分析鉴定的一种独特的结构域．Francesca D 、Ciccarelli 、Peer Bork ［9］等人研究表明，WHy 结构域在植物中具有抗水分胁迫和高敏反应等干燥应答功能．WHy 功能域作为一种干燥响应蛋白，在国内的研究中外鲜有报道，在植物体内的抗水分胁迫应答机制中，是WHy 功能域独自发挥了作用还是能够识别某些特定的序列而协同发挥响应，这一问题有待进一步探究．对转化了DR 1372基因的大肠杆菌进行定性分析发现，逆境下的大肠杆菌中细胞膜很稳定，其细胞膜调节细胞内外渗透压的能力很强．由此推断，将DR 1372基因通过基因工程手段转入植物中，该基因可能会提高植物抗旱性，以此为基础通过培育抗旱品种，以降低干旱对农作物产量的影响．拟南芥是转基因最好的模式植物，由于其基因高度纯合，并且自花授粉，能够快速鉴定基因的相关作用．本研究通过基因工程手段成功将外源基因DR 1372转入了拟南芥基因组中．实验中构建了DR 1372－pBI121载体，载体上带有一个GUS 基因，以及CaMV35S 强启动子和NOS 终止子，能够稳定调控DR 1372基因在植物中的表达．利用冻融法将植物表达载体DR 1372－pBI121载体导入农杆菌GV3103，最后利用根癌农杆菌介导法成功将外源基因DR 1372整合到拟南芥．对DR 1372基因拟南芥幼苗进行盐胁迫反应，发现转基因植株与非转基因植株在盐胁迫反应过程中，当NaCL 浓度较小时，虽然植株的生长都受到了抑制性影响，但转DR 1372基因拟南芥植株的抑制作用明显小于非转基因植株，当浓度达到300mmol /L 时，非转基因植株基本萎焉死亡，而部分抗性植株仍能存活生长，说明DR 1372基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性．本实验通过基因工程手段，成功得到转DR 1372基因阳性植株，盐胁迫处理发现阳性植株比非转基因植株有更强的耐盐功能，这为后续该基因或类似功能基因的抗旱、抗盐性研究提供了丰富的植物材料和理论依据．参考文献：［1］李晓慧，董明伟，刘康．植物抗旱基因及其功能研究进展［J ］．江苏农业科学，2009，5（4）：73－77．［2］Pilon －Smits E A H ，Ebskamp M J M ，Paul M J ，et al．Improved performance of transgenic fructanaccumulating tobacco un-der drought stress ［J ］．Plant Phyiol ，1995，107：125－130．［3］Kishor P B K ，Hong Z ，M iao G ，Hu C A ，et al．Overexpression of pyrroline carboxylase synthase increase proline productionand confersosmotolerance in transgenic plants ［J ］．Plant Physiol ，1995，108：1367－1394．［4］Capell T ，Escobar C ，Liu H ，et al．Overexpression of the oatarg in inedecarboxylase cDNA in transgenic rice affects normaldevelopment patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants ［J ］．Theor Appl Genetics ，1998，97：246－254．［5］Chen J．and Wang Z．Y．Progress in the study of plant mybtranscription factors ，Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao（Journal of Plant Physiology andMolecular Biology ），2002，28（2）：81－88．［6］Anderson ，A．W ，Nordon ，H．C ，Cain ，R．F．，et al．Studies on a radio －resistant micrococ －cus．I．Isolation ，morpholo-gy ，cultural characteristics ，and resistance to gamma radiation ［J ］．Food Technol ，1956，10：575－578．［7］White O ，Eisen J ．A ，Heidelberg J ．F ，et al．Genome sequence of the radio －resistant bacterium Deinococcus radioduransR1［J ］．Science ，1999，286：1571－1577．［8］Cominelli E ，Sala T ，Calvi D ，et a．l Over exp ression of the Arabidopsis AMYB 41genealters cell expans ion and leaf surfacepermeability ［J ］．Plant Journal ，2008，53（1）：53－64．［9］Francesca D．Ciccarelli and Peer Bork ．The WHy domain mediates the response to desiccation in plants and bacteria ［J ］．Discovery Note ，2005，8：1304－1307．［10］Ingram J ，Bartels D．The molecular basis of dehydration tolerance in plants ［J ］．Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol ，1996，47：377－403．［11］刘广宇，魏令波，陈吉龙，等．植物脱水素研究进展［J ］．生物工程进展，2001，21（2）：35－38．［12］陈丽萍，何道一．植物抗旱耐盐基因的研究进展［J ］．生物工程进展，2010，29（3）：542－549．·36·张思维等：农杆菌介导DR 1372基因转化拟南芥的研究第2期On Agrobacterium －mediated Transformation ofDR 1372Gene into Arabidopsis thalianaZHANG Si －wei ，ZHOU Wen －bo ，ZHANG xin ，CHEN Cui －na ，DAI Qi －lin *（School of Life Science and Engineering ，Southwest University of Scienceand Technology ，Mianyang ，Sichuan 621000）Abstract ：DR 1372is cloned from an extremely radiation resistant bacterium which named D．radiodurans．It contains a special domain called Why which may be involved in the mechanism of drought resistance of plants．In this study ，the plant expression vector DR 1372－GV 3103was firstly constructed and DR 1372gene was inserted into Arabidopsis successfully by using the transgenic technique．Then ，positive plants have got a salt stress and the results show that DR 1372gene improves the salt tolerance of Arabidopsis obviously．Thus ，it not only contributes good conditions to later research on DR 1372gene ，but also has great important application in plant gene engineer-ing technology．Key words ：DR 1372；Construction of express vector ；Salt stress ；Arabidopsis thaliana（上接第50页）On Extractives from Natural HerbsUsed in Functional CosmeticsHU Li －chuan 1，MEI Shuang 1，YANG Tong －xiu 1，CHEN Lang 2，YU Zong －lan 2，Guo Ting －ting 2，CHEN Ying 1（1．School of Chemistry ＆Chemical Engineering ，2．School of Life Science and Technology ，Mianyang Normal University ，Mianyang ，Sichuan 621000）Abstract ：This paper is to introduce a new paste functional cosmetic and a percutaneous absorption acne patch with competence of essential oil from wormwood and artemisia apiacea ，their physicochemical index ，antimi-crobial effect ，pox －eliminating effect have been tested ，and the results are as follow ，these two have good stabili-ty ，compatibility ，anti －bacterial activity ，and certain pox －eliminating effect．Key words ：Wormwood ；artemisia apiacea ；essential oil ；cosmetic ；anti －bacterial activity ·46·第32卷绵阳师范学院学报（自然科学版）。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
实验农杆菌转化烟草和拟南芥
活化
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液 体培养基(Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培 养至菌液OD600为1-2
诱导
• 5000 rpm离心5 min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖， 乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL， 接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 活化 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
• 收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释 诱导 至OD600为0.6-0.8
操作要点
侵染烟草叶片无菌操作注意事项 抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验 新鲜的叶片转化效率高 侵染前去除拟南芥已开花和果荚 侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长 侵染后共培养一般为暗培养，1~2d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。
实验ห้องสมุดไป่ตู้告
实验目的 实验原理（简略写） 实验方法 实验结果及分析（最重要） 思考题（最后一次课给）
一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化
一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化郭勇;王玉成;王智博【摘要】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的拟南芥瞬时转化体系影响因素来确定最佳转化条件.以生长15日龄的拟南芥幼苗为试验材料,以转化pCAMBIA1301空载体的根癌农杆菌EHA105为目的菌株进行瞬时转化.研究了吐温20、菌液OD值、乙酰丁香酮(AS)及转化时间等对拟南芥瞬时转化效率的影响.结果表明:以体积分数为0.05％的吐温、菌液OD600值为1.0和120 μmol/L 的AS侵染拟南芥2.5 h后,再共培养72 h,能够得到高瞬时转化效果.【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2016(044)006【总页数】5页(P41-44,83)【关键词】拟南芥;GUS基因;瞬时表达;实时定量;农杆菌介导转化【作者】郭勇;王玉成;王智博【作者单位】林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】Q786拟南芥是重要的模式植物，很多植物基因的功能都是通过基因转入拟南芥中进行研究，而转基因又分稳定表达与瞬时表达两种方式[1]，稳定表达需要的培养、鉴定时间较长，而与之相比，瞬时表达具有简单、快捷、周期短、准确等优点[2]，并且表达效率较稳定，转化率高。
当需要在短时间内进行基因功能的分析或者蛋白间的互作以及蛋白与基因间互作等的研究时，瞬时表达的方法可作为一种高效的手段[3]。
基于瞬时转化技术使基因在宿主体内瞬时表达，是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段,与传统的转基因相比,瞬时表达不需要整合到染色体上，而且瞬时表达还不受基因的位置效应和基因沉默的影响，也不会产生可遗传的子代,生物安全性高[4]。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法转化农杆菌：GV3101农杆菌感受态从-80℃取出，冰上融化，加入2-5ul质粒，去郭老师实验室电激转化（拿杯，洗，，吹干，预冷，加菌液，对准方向插杯，AAgr程序，激完后看时间2.2hv、5.0s 左右，每次需确定程序，需带的东西：镊子、枪、枪头、吹风机、纸、水、废液缸），激后往杯中加入200ul不含抗生素的LB，28℃，200rpm复苏30-60min，之后在含50mg/l Kan （1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、50mg/llRif（1/200，10mg/ml）的LB选择平板上涂板，在28℃培养箱中培养2天（1天可见微小单克隆），挑单克隆划板，28℃培养箱中培养2天。
预摇：挑单克隆至30ml 含50mg/l Kan（1/1000，50mg/ml）、50 mg/l Genta（1/1000，50mg/ml）、25mg/llRif（1/400，10mg/ml）的LB 中，28℃，200rpm，24h。
扩培：以1：100扩培至含400ml的1L锥形瓶中，在28℃，200rpm培养13-16h（从冰箱中取出的菌扩培会慢些一般需要16h），至OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件5000rpm，8min。
转化植株：转化前一天晚上或是转化当天剪去植株上所有果荚和露白的花配制5%的蔗糖溶液（每种500ml），用少量蔗糖溶液摇悬起菌，在转化前再加入0.02%的Silwet L-77。
将植株茎部浸泡在菌液中50s，取出略甩一下后，放入透明塑料袋中，密封保湿。
所有转化完后，扣上黑色塑料袋和盒子，避光培养24h。
一天后，将植株直立放置，浇水培养，3天1次，保证植株水分充足。
过一周后进行再一次转化。
zqy2009-5-7。
拟南芥的遗传转化
XU E SHU TA N TA O学术探讨拟南芥的遗传转化河南农业职业学院刘晓丽魏楠摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥；遗传转化；实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu⁃rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni⁃col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwet L－77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm 离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNase A和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
农杆菌介导的水稻和拟南芥转基因体系建立和转基因植株的分析_图重点
农杆菌介导的水稻和拟南芥转基因体系建立和转基因植株的分析细胞生物学：赵健亮中文摘要水稻是世界上主要的粮食作物之一，超过二分之一的人以其为主食。
随着水稻全基因组测序的完成，加上各种数据库的构建和公布，同时由于水稻具有较小的基因组与禾谷类作物的共线性，成熟的遗传转化体系，使其成为单子叶的模式植物。
因此其基因的功能及相互作用成为基础研究的热点和人类社会发展的要求。
气孔和表皮是研究细胞分化和植物发育的模式系统。
在拟南芥中，气孔和表皮的研究已经取得很大的成果，且日益白炽化，而水稻领域则方兴末艾。
水稻是重要的禾本科植物，是单子叶植物中的模式植物。
农杆菌介导的水稻转基因研究自1994 年以来得到不断地完善与发展。
本研究旨在建立农杆菌介导的水稻遗传转化体系，并研究拟南芥中的两个基因 TMM、FK 在水稻中超表达是否对水稻表型有影响，加深对这两个基因的了解。
AbstractRice is a main cereal crop and staple food for over half of the world population. Rice has also become a model system of monocotyledon plants for genomic studies because of its relative small genome, mature transformation technique, the published various databases and the completion of the genomic sequencing projects of both indica and japonica subspecies.Stomata and epidermal cells were both model systems for studying the cell differentiation and plant development. In Arabidopsis, the great achievements of stomatal and epidermal development have been made. However, there was less correlative advancement in rice.As an important grass, rice is a model plant in monocots. Since 1994, research of agrobacterium-mediated transgenic rice has been continuously improved and advanced. This study was designed to establish agrobacterium-mediated genetic transformation system of rice and to study whether the over-expression of TMM and FK in rice affect the phenotype of rice, and to further understand the functions of these two genes.缩略词表CTAB Cetrimonium Bromide 十六烷基三甲基溴化铵dNTP Deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 GMC Guard mother cell 保卫细胞母细胞IPTG Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷LB Luria-BertaniPCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 X-gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷ZH 11 Zhonghua 11 中花11GMC gurd cell mother cell 保卫细胞母细胞 GC gurd cell 保卫细胞GL glome like 类颖体第一部分前言1、水稻基因组研究现状及意义水稻(0ryza.sativa是世界上主要的粮食作物之一，全球近一半的人以大米为主食(主要集中在亚洲、非洲和南美。
拟南芥转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。
2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。
3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。
转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。
本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。
实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。
将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。
将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。
将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
农杆菌介导DR1172基因转化拟南芥
农杆菌介导DR1172基因转化拟南芥张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲【期刊名称】《基因组学与应用生物学》【年(卷),期】2012(31)6【摘要】耐辐射奇球菌(D.radiodurans,DR)能在极端胁迫条件下生存,并且拥有一个独特的极端环境抗性基因组而被广泛用于研究。
其中DR1172是在耐辐射球菌中分离出的一段基因,与LEA76家族同源,参与植物的抗旱机制。
本研究利用基因工程手段以载体pBI121为基础构建植物DR1172-GV3103表达载体,然后利用花序浸染法将目的基因DR1172转入模式植物拟南芥中,T2代得到50株植物,阳性为15棵,转化率为30%。
该研究为探讨DR1172基因的功能以及植物抗逆机制提供了丰富的拟南芥材料,而且对利用基因工程技术手段改良植物性状,培育出抗逆性强的植物优良品种有重要的指导价值。
【总页数】5页(P582-586)【关键词】拟南芥;DR1172;载体构建;遗传转化;抗旱【作者】张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲【作者单位】西南科技大学极端环境生物资源利用实验室;中国农业科学院生物技术研究所【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥 [J], 段红英;丁笑生;周延清;周春娥2.农杆菌介导DR1172基因转化甘蓝型油菜的研究 [J], 张新;崔广艳;陈翠娜;张思维;代其林;王劲3.农杆菌介导DR1372基因转化拟南芥的研究 [J], 张思维;周文波;张新;陈翠娜;代其林4.农杆菌介导的TaLEA1 基因对拟南芥的遗传转化 [J], 包宇;赵咏梅;俞嘉宁;杨建雄5.用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥的研究 [J], 龚元亚; 代其林; 杨娟; 鲜先毅; 孙英坤; 谢琳; 王劲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
转基因拟南芥实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。
2. 学习拟南芥转基因方法，包括农杆菌介导转化和基因枪法。
3. 鉴定转基因植株，并分析其遗传稳定性。
二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株（野生型、突变型）2. 农杆菌菌株（如Agrobacterium tumefaciens C58）3. 转基因载体（含目的基因、抗生素抗性基因）4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆：根据目的基因序列设计引物，从基因库中克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：将目的基因克隆到载体上，并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。
3. 农杆菌转化：将转基因载体转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株，筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否成功插入。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性。
四、实验结果与分析1. 目的基因克隆：成功克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：成功构建转基因载体，并插入抗生素抗性基因。
3. 农杆菌转化：成功转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：通过喷洒或浸泡转化介质，成功筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，成功检测到目的基因。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性，结果表明转基因植株遗传稳定性良好。
五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法，具有操作简便、转化效率高等优点。
2. 在转基因过程中，抗生素抗性基因作为筛选标记，可以有效筛选出转基因植株。
3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段，可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。
4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节，有助于确保转基因植物的安全性。
农杆菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
实验六农杆菌介导转化拟南芥
Hyg基因或Lac Z基因等。
双元载体系统旳转化原理是Ti质粒上 旳Vir基因能够反式激活T－DNA 旳转移。
外外源源基基因因 切
3 转化措施
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质 体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。
• 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得 到广泛应用。
试验流程
1. 挑取活化旳含目旳基因质粒旳单克隆阳性农杆菌GV3101菌 株至5ml 新鲜YEB液体培养基（50g/ml Kan，125g/ml Rif）中，28℃摇培24h。
科植物，二年生草本，高7～40厘米，花期3～5 月。广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生 物学旳研究，已成为一种经典旳模式植物，其原 因主要基于这种植物具有下列特点：
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小旳，但是具有完毕“复 杂”旳植物生长发育旳全部基因；
试验六、农杆菌介导转化拟南芥
试验目旳：学习真核生物旳转基因技术及农杆菌介 导旳转化原理。
•试验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 旳试验措施， 了解拟南芥旳生理特点及在基因工程试验中应用。
• 技术应用：一种以便，高效旳植物转基因措 施，多用于转化双子叶植物，经过改善后也 逐渐用于单子叶植物旳转化。
• 试验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 体现载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
Vir区
2.3 双元体现载体系统源自•双元体现载体系统主要涉及两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，此类Ti质粒因为缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
农杆菌实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌介导的植物基因转化方法。
2. 学习基因转化过程中的操作技巧。
3. 研究农杆菌介导的基因转化在植物遗传育种中的应用。
二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤细菌，它具有将T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞中的能力。
在植物基因转化实验中，利用农杆菌将目的基因导入植物细胞，进而实现基因的遗传转化。
本实验采用农杆菌介导的方法，将目的基因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞中。
三、实验材料1. 拟南芥植株2. 农杆菌菌株（E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens C58）3. 载体DNA（含目的基因）4. 限制性内切酶和连接酶5. 载体质粒（含T-DNA序列）6. 抗生素（卡那霉素和壮观霉素）7. 培养基和试剂四、实验方法1. 构建重组载体：将目的基因克隆到载体质粒中，并构建重组载体。
2. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共同培养，使目的基因转移到农杆菌中。
3. 农杆菌感染：将转化后的农杆菌与拟南芥植株进行共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 抗性筛选：将感染后的拟南芥植株在含有抗生素的培养基上培养，筛选出含有目的基因的植株。
5. 基因表达检测：通过PCR、RT-PCR等方法检测目的基因在转化植株中的表达情况。
五、实验结果与分析1. 重组载体的构建：通过PCR和测序验证，成功构建了含目的基因的重组载体。
2. 农杆菌转化：经过共培养和感染，拟南芥植株表现出明显的抗性。
3. 抗性筛选：在含有抗生素的培养基上，成功筛选出含有目的基因的植株。
4. 基因表达检测：通过PCR和RT-PCR实验，证实目的基因在转化植株中得到了表达。
六、实验结论1. 成功构建了含目的基因的重组载体。
2. 农杆菌介导的基因转化方法在拟南芥中取得了较好的效果。
3. 通过抗性筛选和基因表达检测，验证了目的基因在转化植株中的稳定遗传和表达。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
做遗传转化实验报告
实验日期：2023年10月15日实验目的：1. 掌握遗传转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞，并观察转化效果。
3. 了解转化频率、表达效率等遗传转化相关指标。
实验原理：遗传转化是指将外源基因通过一定的方法导入受体细胞，使其在细胞内表达的过程。
植物细胞遗传转化通常采用农杆菌介导法，利用农杆菌的Ti质粒将外源基因整合到受体细胞的染色体上。
本实验以拟南芥为受体植物，将绿色荧光蛋白（GFP）基因导入其中，观察转化效果。
实验材料：1. 拟南芥种子2. 农杆菌菌株：E. coli DH5α3. 农杆菌菌株：Agrobacterium tumefaciens GV31014. GFP基因质粒：pBI1215. 抗生素：卡那霉素、氯霉素6. 实验器材：超净工作台、离心机、移液器、消毒液、培养皿、培养箱等实验步骤：1. 种子消毒：将拟南芥种子用70%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次。
2. 农杆菌活化：将E. coli DH5α和Agrobacterium tumefaciens GV3101分别接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。
3. 质粒提取：按照试剂盒说明书提取pBI121质粒。
4. 农杆菌转化：将活化后的Agrobacterium tumefaciens GV3101与pBI121质粒混合，37℃培养3小时。
5. 拟南芥接种：将消毒后的拟南芥种子接种于含有农杆菌的培养基中，28℃暗培养3天。
6. 转化植株筛选：将接种后的拟南芥转移到含有抗生素的培养基上，筛选转化植株。
7. GFP表达检测：将转化植株置于紫外灯下观察GFP表达情况。
实验结果：1. 成功转化拟南芥植株，转化频率约为10%。
2. 转化植株中，GFP表达率为100%。
讨论与分析：1. 本实验采用农杆菌介导法成功将GFP基因导入拟南芥细胞，转化频率较高。
2. 转化植株中GFP表达率为100%，说明外源基因在拟南芥细胞中得到了有效表达。
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• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
•
另一部分是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在
T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如
4. 将待转化的拟南芥植株平放，将花蕾部分插入2mlEP管中， 加入上述转化液，浸染5min(如图)。轻轻甩掉浸液，做好 标记。
农杆菌介导转化拟南芥
转化后的管理
• 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中， 并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后， 将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足 horgland营养液，恢复正常培养。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
实验目的：学习真核生物的转基因技术及农杆菌介 导的转化原理。
•实验要求：掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法， 了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
• 技术应用：一种方便，高效的植物转基因方 法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也 逐渐用于单子叶植物的转化。
• 实验材料： 农杆菌GV3101重组菌株，重组双元 表达载体pCAMBIA1300 ，拟南芥
• （4）拟南芥是自花授粉植物，易于获 得纯合突变体。
• 1.2 拟南芥的培养：
• 将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种 于MS培养基上，于22℃、光照10h培养12周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1） 混合物上培养。
• 注意： 湿度要大一些。
2.转化原理
• 2.1 农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛， 在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
• 试剂： YEB液体培养基，Kan（卡那霉素）， Rif（利福平）；
转化介质 ：1/2 MS大量，1×铁盐，1×微量， 1×有机，5%蔗糖， 0.01µg/ml 苄氨基嘌呤 (BAP)，0.03%silwetL-77，20 mg/L乙酰丁香酮， KOH调pH值至5.7。
1 拟南芥
1.1 简介： 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种十字花
Hyg基因或Lac Z基因等。
双元载体系统的转化原理是Ti质粒上 的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
外外源源基基因因 切
3 转化方法
• 根据受体材料不同分为浸花法、原生质 体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法。
• 其中 浸花法、叶盘法在许多植物上得 到广泛应用。
实验流程
1. 挑取活化的含目的基因质粒的单克隆阳性农杆菌GV3101菌 株至5ml 新鲜YEB液体培养基（50g/ml Kan，125g/ml Rif）中，28℃摇培24h。
• 2.2 根癌农杆菌含有 Ti (tumor-inducing plasmid)质粒，Ti 质粒上的 T-DNA （transferred DNA）在 Vir区（virulence region）基因产物的介导下可以插入到植物基因组 中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将 外源目的基因插入到 T-DNA 中，借助 Ti 质粒 的功能，使目的基因转移进宿主植物中并进一步 整合、表达。