5-6 突变位点的检测

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突变位点的检测技术
蛋白截断技术（PTT）
由于基因的非缺失型突变多可能造成翻译过程的提前终止(突出表现 为点突变形成终止密码子)，其蛋白质产物为截短肽链；在SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳，这种突变杂合子电泳显示有两条带为全长肽链和截短的 肽链。
优点：从蛋白水平上检测基因突变；对检测长片段缺失或插入引起的 移码突变有相当的敏感性；单次分析的基因片段可达2kb；研究报道显示 基因突变检出率达90％以上。
DNA遗源自文库标记
• 依据DNA遗传标记进行基因分型。 • P473基因型（genotype）：
人：除性染色体外，人类细胞内的染色体都有两份， 一个人所拥有的一对等位位点的类型被称为--。 泛指：同一基因座位上多个等位位点的类型。
• 基因分型（genotyping）：确定某个个体基因型的 实验。
• 等位位点（P66）：指染色体DNA同一位置上的每 个碱基类型。
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遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术
PCR
SNP检测技术
（课下拓展，各技术有何优缺点）
限制性酶切片段长度多态性分析-RFLP 单链构象多态性分析-SSCP 毛细管电泳 变性高效液相色谱-DHPLC 异源双链分析-HA 变性梯度凝胶电泳分析-DGGE DNA芯片技术-DNA chip 实时荧光PCR分析 直接序列测定， … …
• 优点：与RFLP标记相比SSR检测的多态性频率高得多。
• 应用：基因定位、DNA指纹分析、遗传分析和疾病诊断等。
• 缺点：要克隆足够数量的SSR并进行测序，需要投入足够的 资金、人力和时间。
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DNA遗传标记
• 第三代标记：SNP • 定义：基因组DNA序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。 • SNP是基因组中最简单、最常见的多态形式，具有很高的
• 插入/缺失突变：DNA序列插入/缺失一个或多个核 苷酸的突变。
• eg. 转座子（复制型转座子、非复制型转座子）。
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基因突变
• 点突变：指一种碱基通过化学修饰、遗传变异、复 制错误等引起的单一碱基的改变。
• 分为转换（transition）和颠换（transversion）。 • 转换最常见，约占SNP的2/3。
42）。 • 3~4个相邻的SNP标记构成的单体型就可有8~16种。
SNP
• SNP分类： • 根据SNP在基因组中的分布位置，可分为：
cSNP（1/5）、pSNP、rSNP。 • 从对生物遗传性状的影响上看，cSNP又可分为：
同义cSNP、非同义cSNP 。 • SNP的应用（P69）： • 人类基因单体型图的绘制 • SNP与疾病易感基因的相关性分析 • 指导用药与药物设计 • 动物、植物、微生物的遗产改造/育种
DNA遗传标记(P437)
• 第一代标记： 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 定义：用限制性内切酶特异性切割DNA链，由于DNA的一 个“点”上的变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生 不同长度的片段，可用凝胶电泳显示多态性。
• 优点：广泛用于检测已知DNA点突变，可以检测大到几千 个碱基对DNA片段；对SNP位点检测和基因分型均能较准 确的判断。
优点：操作简便，测序时间短。 缺点：费用昂贵，仅适合于小样本量分析。
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思考
• 简述DNA遗传标记的种类？
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突变位点的检测技术
变性梯度凝胶电泳法（DGGE）
原理：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝 胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降；当解链的DNA链中有
缺点： 主要检测由于导致ORF改变的突变；且该技术要求检测的标 本来自活检组织，或抽提RNA获得目的基因的cDNA经体外翻译为蛋白 再进行检测；所检测的蛋白需要分离纯化以及排除杂质条带的干扰，故 在实际应用中受到限制。
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遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术
SNP (P66)
• SNP广泛存在于人类基因组中。 • 单倍/体型（haplotype）：位于染色体上某一区域的一组相
关联的SNP等位位点被称为--。 • 相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代（图2-
缺点：由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专的 电泳装置，合成的PCR引物最好在5’末端加一段40bp-50bp的GC夹，以 利于检测发生于高熔点区的突变。
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突变位点的检测技术
变性高效液相色谱检测（DHPLC）
原理：含有突变位点的PCR 扩增产物经变性、退火，将形成同源和异 源双链两种DNA 分子。在部分变性条件下，发生错配的异源双链DNA 更 易于解链为单链DNA，与DNASepⓇ 柱结合力降低，比同源双链DNA 分 子更易于被乙腈洗脱下来，从而与同源双链DNA 分离。
遗传稳定性。 • 已经在人类基因组中发现了超过1000万个SNP位点，平均
约每300bp就有一个SNP。 • 绝大多数SNP位于非编码区。 • 优点：可用于检测未知突变；可以与DNA芯片技术相结合
实现自动化检测。 • 缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受检测条件影响。
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一 个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度不 同而被分离。
优点：检测片段可达1kb，最适范围为100bp-500bp，如果突变发在 最先解链的DNA区域，检出率可达100％；检测结果无假阳性重复性好， 准确率高，可判断基因型；该法一经建立，操作也较便，适合于大样本的 检测筛选。
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遗传标记
• 遗传标记：形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记 • 分子标记（Molecular Markers） • 广义：可遗传并可检测的特异DNA序列、RNA或蛋白质。 • 狭义：指DNA或RNA标记。 • DNA遗传标记：指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基
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突变位点的检测技术
单链构象多态性（SSCP）：
是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链 DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象，在电泳 时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时， 靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位。
础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。 • DNA遗传标记的种类（P436）： • 限制性片段长度多态性RFLP、简单重复序列（SSR）、
SNP。
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遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术
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突变位点的检测技术
异源双链分析法（HA） 原理： 由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链
DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时， 会产生与相应的同源双链DNA不同的迁率。
优点：HA是SSCP法鲜为人知的姊妹篇，操作也比较简 便。 HA和SSCP两种方法突变检测模式不同，两种方法 可以同时在同一张凝胶上进行，二者可以相互掩盖对方的 缺点与不足，使突变检出率提高到近100％。
优点：快速简单、自动化程度高，使SNPs的分析更加便捷， 具有很大的发展潜力；还可用于基因定位、DNA测序、物理 图谱和遗传图谱的构建等。
缺点：需要专门的仪器、试剂，费用较高。
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SNP检测技术
直接测序测定：
是诊断未知突变基因最直接的方法，其方法是将PCR产 物在自动测序仪上直接测序。
优点：简单快速，价廉，特别适合大样本的筛选；用SSCP法检测小 于200bp的PCR产物时，检出率可达70％-95％。
缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受凝胶交联度、电泳温度、片 断长度等条件影响，当片段大于400bp时，检出率仅为50％左右；同时 该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。
优点：操作方便简单，实验时间是现有方法中最短的，重 复性强，适合于大量样本的检测；同时整个实验是在闭管的 状态下完成，可以非常有效避免污染；结果判断借助仪器软 件自动判读，客观性强。
缺点：只能对已知的多态性位点进行分析；需要专门的仪 器、试剂。
SNP检测技术
基因芯片法 (DNA chip) ： 原理：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）。它是集成 了大量的密集排列的已知序列探针，通过与被标记的若干靶 核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基 因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补 匹配的原理确定靶基因的序列。
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2 主要核酸操作技术
核酸凝胶电泳技术 核酸分离技术 PCR技术 mRNA的纯化和文库的构建 基因克隆技术 DNA序列分析技术 突变位点的检测
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遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术
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遗传标记 DNA遗传标记 基因突变 SNP SNP检测技术
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基因突变
• 定义：由于体内外各种因素使基因特定的DNA序列 的碱基组成或排列顺序发生改变，导致DNA一级结 构改变。
• 根据分子机制不同分为：插入突变、缺失突变、点 突变 。
优点：分离DNA分子快速，操作自动化、简便，经济； PCR产物无 须 进行纯化处理即可用于突变检测；能准确测定DNA片段大小，基因突变检 出率高（达95-100%） 。
缺点： DHPLC 检测的灵敏性、特异性受PCR引物、PCR 体系及反 应条件、检测温度、DNASepⓇ柱质量以及流动相梯度等多重影响。
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SNP检测技术
PCR-RFLP：
原理：先用PCR技术扩增目的基因片段，由于DNA个别 碱基的突变，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改 变，用限制酶切割目的片段，所产生的片段数目和每个片段 的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。 P427：
缺点： 只能分离双链DNA；也只适合于小片段的分析。
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SNP检测技术
实时荧光PCR分析 原理：使用针对核酸中不同多态性序列的荧光探针，只有
与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割，它们在PCR扩 增中被水解切割释放出荧光信号，不同探针标记不同的荧光 报道信号。
• 缺点：限制性酶切过程中不可避免的遭遇到酶切不完全或 DNA降解的现象，且只能检测已知多态位点，不能罕见的 或未知的突变位点；每次酶切2-3个片段，信息量有限；限 制性内切酶价格较昂贵。
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DNA遗传标记
• 第二代标记：简单重复序列（SSR）
• 定义：真核生物基因组中散布有由大量由简单重复序列所组 成的微卫星和由串联重复短序列组成的小卫星。在小卫星或 微卫星的两端往往是相对保守的限制性内切酶位点。通过特 异性引物进行PCR扩增、凝胶电泳和放射自显影（或银染）， 可以检测到在简单重复序列中由于重复单位数不同而造成的 DNA区域的多态性。