固定化酶与固定化细胞

精品医学ppt
11
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素
蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附 量也增加，直至饱和。
pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 载体：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比 小分子慢得
第四章 固定化酶与固定化细胞
精品医学ppt
1
本章内容
酶的固定化 (1)为什么要固定化? (2)怎样固定化?(固定化方法) (3) 固定化酶的特性
细胞的固定化 (1)细胞固定化所用的方法 (2) 固定化细胞的特性
辅酶的固定化
精品医学ppt
2
一 酶的固定化
什么是固定化酶？
指固定在一定载体上并在一定空间范围内进 行催化反应的酶。
水相固定化法 这是最常见的吸附固定化方法，即 将酶溶解于缓冲液中，加入载体，振荡或搅拌一定 时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥即可得固定化酶
载体表面涂布法 将酶溶入少量缓冲液中，加入载 体，混合均匀，冷冻干燥可得固定化酶。此法相当 于直接将酶涂布于载体上，避免了水相固定化中酶 的大量流失
溶剂沉淀法 即在低温下向含有载体的脂肪酶液中 加入酶的有机溶剂作沉淀剂(如丙酮)使酶析出，沉 淀在载体表面。此法所得固定化酶酶活性较高，载 体性质对固定化无明显影响，但酶在载体表面分布 不均匀
同时对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越 强。多孔性载 体，要考虑吸附对象的大小 和总吸附面积的大小。
精品医学ppt
12
吸附法特点
优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级 结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活 性酶
缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强 度下酶易从载体上脱落
精品医学ppt
13
吸附法（制备的工艺）
此法得到的固定化酶结合牢 固、稳定性好、利于连续使 用，因此它是目前应用最多 的一类固定化酶的方法。
精品医学ppt
16
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性 好、利于连续使用。
共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激 烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化 活性产生影响。
阻碍了微生物酶的应用和发展。 研制固定化酶和固定化菌体
精品医学ppt
4
(一)为什么要固定化?
在一定程度上可以改善酶的稳定性； 可以多次反复使用，有利于采用连续操作工
艺，从而使酶和细胞的使用率提高，降低生 产成本； 酶和细胞不混入产物，可精简产物分离工序。
精品医学ppt
5
(1)固定化在一定程度上可以改善酶的稳 定性
精品医学ppt
14
吸附法（制备的工艺）
游离固定化法 将具有一定亲水性的载体分散于疏水溶剂中， 另将酶粉溶入少量缓冲液的酶液加入，振荡可搅拌一定时间后， 便得固定化酶。其原理是：亲水性载体可在其表面形成一层水 膜，酶分子不溶于溶剂，只能存在于这层水膜中，因而可以完 全被固定化
微晶体法 将可Baidu Nhomakorabea晶的物质和酶溶液混合在一起，然后滴入亲 水有机溶剂中，当可结晶物质结晶析出时，酶就有规则吸附在 晶体表面上
精品医学ppt
7
(3)可精简产物分离工序
底物和产物更容易 和酶分离
精品医学ppt
8
(二) 怎样固定化?(固定化方法)
精品医学ppt
9
固定化的第五种方法 变性法
在不使用载体的情况下，借助加热、冰冻或 β-射线等物理手段，也可通过添加柠檬酸、 各种絮凝剂、交联剂或变性剂处理，使细胞 内起破坏作用的蛋白酶变性、细胞结构固定 和菌体聚集成大颗粒达到固定化的目的。此 法制备的细胞一般只用于完成单酶或少数几 种酶催化反应。
反应式及原理
A．重氮法
精品医学ppt
19
B 叠氮法
例 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋
白酶，步骤如下：
⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
精品医学ppt
20
B 叠氮法
对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚
精品医学ppt
10
(1) 吸附法
物理吸附是通过氢键、疏水键和π电子亲和力 等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。 常用的载体有高岭土、皂土、硅胶、磷酸钙 胶、氧化铝、微孔玻璃等无机吸附剂
离子交换吸附是在适宜的pH和离子强度条件 下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的 相互作用而达到固定化的一种方法。最常用 的交换剂有CM－纤维素、DEAE－纤维素、 DEAE－葡聚糖凝胶等。
电沉积法。在酶溶液中放置两个电极，在电极临近加入载体， 通电后，酶移向电极，并沉积到载体表面的固定化方法。采用 这种方法时需事先确定载体和酶在电场中是否会分解和失活。 在沉积过程中和酶活性、稳定性有关的某些离子如果发生移除、 损漏，那么就必须即时补充、替代。
精品医学ppt
15
(2) 共价结合法
借助共价键将酶的活性非必 须侧链基团或细胞表面基团 （如氨基、羧基、羟基、巯 基、咪唑基等）和载体的功 能基团进行偶联以达到固定 化目的方法。
固定化增加了酶的耐 热性（热变性原理）
固定化增加了酶对蛋 白变性剂（尿素，盐 酸胍）等的抵抗能力
固定化减少了蛋白酶 的作用（阻碍了活性 部位的接近）
精品医学ppt
6
(2)固定化使酶和细胞的使用率提高
江南大学的孙志浩通过卡 拉胶包埋的方法，使酶的 重复利用30个批次后活性 没有明显减少，大大促进 了酶的利用率，加速了工 艺工业化进程．
精品医学ppt
17
纤维素
共价结合法example
重氮法 溴化氰法 烷基化（三氯匀三嗪） 叠氮法
CMC － CH2COOH +盐酸甲醇
CMC－甲酯
＋肼
制备酰肼 叠氮化物
CMC－酰 肼 亚硫酸钠 ＋ 盐酸
CMC－叠氮化 物
＋酶 NH2 固定化酶 －CNHH2CO- 酶
羧甲基纤维素叠精品氮医学法ppt 制备固定化葡萄糖淀粉酶18程序
精品医学ppt
3
(一)为什么要固定化?
直接利用微生物酶——
（1）不稳定。在高温、高压、强酸、强碱下。 （2）易失活。即使在最适合的条件下反应。 （3）回收困难。用适当方法提取目的产物后，残存酶回
收困难。 （4）反应速度减慢。不容易和毒副分子和产物分离. （5）经济上不合算。一次性反应后不能再次使用。