固定化酶和固定化细胞技术

张 海 龙

山东教育学院 生物系

Shan Dong Institute of Education

第九章　第九章　固

固定化酶与固定化细胞技术

第一节固定化酶

•固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。

•酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比）

•（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；

•（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化；

•（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性；

•（4）酶的反应过程能够严格控制；

•（5）酶的利用率提高，生产成本降低；

•（6）能够进行多酶反应；

•（7）可以增加产物收率，提高产物的质量；

•（8）增加了生产的成本；

•（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法

•根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则：

–（1）必须维持酶的催化活性以及专一性；

–（2）有利于实现连续化和自动化；

–（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量；

–（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用；

–（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应；

–（6）成本要低，以便于工业使用；

实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。•（一）包埋法：

–1、网格型

–2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法•（二）吸附法：

–1、物理吸附法

–2、离子吸附法

•（三）、共价偶联法

•（四）、交联法

•（五）、共价结合法

–1、结晶法

–2、分散法

酶固定化方法示意图

二、固定化酶的性质

1、稳定性

2、最适温度

最适pH pH

3、最适

4、底物特异性

go

稳定性

比游离酶的好

（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度

20406080100

30405060708090

Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A B

A 固定化酶

B 游离酶

稳定性(续)

（2）保存稳定性好，保存时间延长

（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白

（4）对变性剂）对变性剂((如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等))的耐受性提高，保留较高酶活

（5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pH pH pH稳定性提高稳定性提高稳定性提高.

.

(back back))

最适温度

与游离酶差不多

05010015020025030035030

40

50

60

70

80

Temperature ( ºC )

R e l a t i v e a c t i v i t y (%)

A B

最适温度(续)

例外

用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，

5-10℃;

比游离酶高

比游离酶高5-10

5-15 ℃以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高

汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为

30 ℃同一种酶;

80 ℃，比固定化前提高了

，比固定化前提高了30

用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同

不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 <60

烷基化法

DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶

葡聚糖凝胶 67离子键结合法DEAE-DEAE-纤维素纤维素 72离子键结合法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60游离

最适温度最适温度(

(℃ ） 方法

载体载体

最适pH 值

酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pH pH pH和酶和酶—pH pH曲线常发生偏

曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响

带负电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的高

(1)载体的带电性质对最适pH 的影响

原因:吸引作用

带正电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的低

H +

H +

H +H +

H +

H +H +偏酸微环境

OH -OH -OH -

OH -

OH -

OH -H

+

H

+

大环境偏碱

酶

不带电荷的载体，固定化酶最适pH 值一般不变

(2)产物酸碱性对最适pH 值的影响

酸性酸性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值一般不变值一般不变原因原因:

:载体障碍产物的扩散