CD细胞及分离方法演示文稿

CD34+细胞分离方法比较
分离方法 细胞得率 难易程度 细胞纯度 分离速度 条件
荧光激活细 少
难
高
慢
高
胞计数
免疫磁珠吸 大
易
高
快 经济
附分离
细胞物理特 低
易
低
快 经济
性分离
免疫磁珠吸附分离CD34+细胞
利用抗CD34单克隆抗体与抗原特异结合 的特性，通过二抗介导的免疫磁珠结合， 使用Miltenyi的磁性细胞分离仪，有效的 分离纯化CD34+细胞，进一步用于造血 细胞培养，扩增，基因转染，建立造血 干细胞库等实验。
结果
脐血CD34+细胞的分离结果
MNC扩增到第28天，细胞总数开始 呈下降趋势，而另一组则持续扩增8周。 在前4周中，MNC的扩增倍数远低于 CD34+富集细胞
造血干/祖细胞集落密度分析
细胞于半固体培养体系中进行集落分析，MNC的CFUGM和BFU-E集落密度都有上升，下降的过程，而CD34+ 富集细胞集落密度始终呈下降趋势，相似的是两者BFU-E 到第3周就很难检测到了。
王斌，康自珍，迟占有等。体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞。 生物工程学报，2002,5(18),343-347.
方法
1.Ficoll 密度梯度离心收集单个核细胞; 2.免疫磁珠分离纯化CD34+细胞. 3.MNC接种密度为5*105 cells/ml. CD34+细
胞为2*104 cells/ml于24孔板，每周取样计数， 集落检测和流式细胞分析.
细胞物理参数系统分离CD34+细胞 得率较低，而且需要提供足够的细 胞量。
目前常用于分离CD34+细胞的方法主要 是免疫吸附法（ systems based on immunoadsorption)。
尤其是用免疫磁珠吸附分离（immune adsorption on ferromagnetic beads) 的方法应用更为广泛。
分离CD34+细胞的方法
荧光激活细胞分选
免疫吸附系统 （淘选法；免疫吸附柱层析 法；免疫磁珠法）
细胞物理参数系统（密度梯度离心法；离心计 数流式法）
流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)可获 得高纯度的CD34+细胞，但是由于 得量较Байду номын сангаас，受无菌实验条件等方面 的限制，所以应用较少。
而CD34+富集细胞的集落只实现了 数量上的扩增，单个细胞所形成的集 落数并没有明显的增高过程。
显示，MNC的CD34+细胞的扩增倍数在第14天达 到了最大值，随后开始下降，CD34+富集细胞则如终 呈上升趋势，在第35天达到了最大值。
经过体外长期培养，由CD34+富集细胞培养所得 的CD34+细胞总数和CFU-GM（粒细胞-单核细胞集 落生成单位）总数均高于MNC。
分离后， CD34+细胞可达95-99%。CD34+抗原 组则99.6%的细胞为CD34-细胞。
回收率达70-75%，免疫磁珠分离方法得到的 CD34+细胞纯度和回收率均较高。
体外培养脐血单个核细胞与 CD34+富集细胞的比较
目的：在相同的条件下体外培养脐血单个核细 胞（MNC）和CD34+富集细胞，对比考察这 两种细胞扩增，集落形成和CD34+细胞扩增等 特性。
CD细胞及分离方法演示 文稿
优选CD细胞及分离方法
CD34+细胞
CD34+细胞是造血干细胞的表面标志分 子。
细胞表面CD34+抗原是一种相对分子质 量为110-120kD的高度糖基化的Ⅰ型膜 蛋白。它主要存在于幼稚的造血干细胞 和造血祖细胞质膜上，部分骨髓基质细 胞以及少量内皮细胞表面。
CD34+细胞在骨髓，脐带血以及外周血中 都有存在。用常规方法一般难以有效分离。 原因主要在于CD34+抗原表达的拷贝较低， 抗CD34+的亲和力低，表达CD34+抗原的 细胞存在于一个不均一的本底细胞群中， 且数量极少。
小结
经过体外培养，培养前期MNC的CD34-可 能对CD34+细胞及集落形成细胞的扩增有 促进作用；
而CD34+富集细胞在培养过程中分化趋势 始终大于扩增，其总细胞的大量扩增则说 明在培养中存在大量分化。
实验材料：
1.脐带血，外周血及骨髓标本； 2.PBS缓冲溶液； 3.10%BSA； 4.10mmol/LEDTA； 5.淋巴细胞分离液； 6.MACS磁性分离仪； 7.MACS分离试剂盒；
操作步骤
1. 配制含1%BSA和5mmol/L EDTA的PBS缓冲 溶液。
2. 利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞； 3.将1*108个单个核细胞悬浮于300ul缓冲液中，
集落密度=集落/细胞数
造血干/祖细胞总集落扩增分析
MNC的CFU-GM和BFU-E的扩增倍数在14天达到最大 值，然后开始下降。CD34+富集细胞的CFU-GM第35天 达到最大值， CFU-E在第14天达到最大值。后者的CFUGM最大扩增倍数远大于前者。
总集落数=集落密度*细胞总数
分析可以看出，MNC的集落在培养 过程中其集落密度和集落数量都曾实 现了增高。
利用MACS磁性分离试剂盒制备细胞悬液500ul； 4. 将分离柱固定于MACS磁场内，将标记细胞缓
慢通过分离柱。洗脱组分为CD34-细胞； 5.将分离柱移出磁场，加1ml 缓冲液加压洗脱，
收集CD34+细胞。 6.用免疫细胞化学和FACS分析CD34+细胞纯度
分离结果
分离前，脐带血和骨髓的CD34+细胞占单个核细 胞的1-4%，外周血仅为0.2% 。