实时荧光定量PCR——TaqMan探针法及设计原则课件
两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则
两种定量分析方法的比较及Taqman 探针、引物设计原则 遗传物质DNA 首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA （mRNA ）,携带遗传信息的mRNA 从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA 完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵，PCR 扩增和检测同时进行；在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR 常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct 值 扩增曲线：反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会自动记录 荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设臵的原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT 值： PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 扩增曲线 阈值及CT 值 荧光定量PCR 的数学原理 理想的PCR 反应： X=X0*2n 非理想的PCR 反应： X=X0* (1+Ex)n （n ：扩增反应的循环次数；X ：第n 次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex ：扩增效率） 在扩增产物达到阈值线时 : C(t) value
荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR原理和实验
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则
两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 扩增曲线阈值及CT值 荧光定量PCR 的数学原理
实时荧光定量PCR仪ViiA7操作步骤
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
实时荧光定量 原理 taqman 探针简介
实时荧光定量 PCR技术原理与应用 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧 光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再
呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）（如图 2 所示）。
荧光定量PCR实验指南(一)
荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从https://www.360docs.net/doc/df15836466.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定
比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR操作步骤
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC
荧光探针
荧光探针(fluorescent probe)在化学传感、光学材料及生物检测和识别等领域得到了广泛的应用，并成为实现上述功能的一种主要的技术手段。但以传统的有机荧光染料为主的荧光探针在应用中也存在一些难以克服的缺陷。最近，无机发光量子点、荧光聚合物纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子等荧光纳米探针的相继出现，在一定程度上克服了传统有机荧光试剂的缺陷，为生物分析提供了新的发展领域，成为了近年来研究的热点，在此我想作一简单介绍，希望能起到抛砖引玉的作用，如果大家觉得我有什么地方说错的话，欢迎批评指正！让我也从中受益！ 1、荧光纳米粒子的分类 荧光纳米粒子是指可以发荧光的半导体纳米微晶体（量子点）或将荧光团(Fluorophore)通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。与传统的荧光染料相比，荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。另外，随着纳米制备技术的进一步提高，对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，这在很大程度上使荧光纳米粒子满足了化学传感器、生物探针等领域的要求。目前荧光纳米粒子主要有无机发光量子点、荧光高分子纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子三大类。 1.1.量子点 量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体，是由数百到数千个原子组成的无机纳米粒子，是一种由II-VI 族或者III-V 族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是CdX(X = S、Se、Te)。量子点粒径很小，它们的电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。量子点的体积大小严格控制着它的光谱特征。量子点的晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即存在量子尺寸效应，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰也相应蓝移。可见，相对于其他传统的荧光染料而言，量子点由于其量子尺寸效应，粒径不同或组成材料不同即可发射不同颜色的荧光。由于量子点潜在的应用前景，研究者在量子点的制备方面展开了一系列的研究。 目前，量子点的制备方法根据其所用材料的不同，有以下两种方法：一、在有机体系中采用胶体化学方法以金属有机化合物为前体制备量子点，二、在水溶液中直接合成。在有机体系采用胶体化学方法制备量子点的研究中，Bawendi等将金属有机化合物注射入热的有机溶剂中，在高温下制备出具有单分散性的CdSe量子点。后来，人们使用无机物来钝化颗粒表面，发展了核壳结构的量子点。peng等人以CdO或Cd(Ac)2为原料，在一定条件下与S、Se、Te的储备液混合，一步合成了性能良好的CdS、CdSe、CdTe量子点。Nie等以此法合成了CdSeTe量子点，其荧光发射最大的波长为850 nm，量子产率高达60%。该法不但克服了先前合成方法中需要采用(CH3)2Cd作为原料的缺点，而且所合成的量子点荧光量子产率高、尺寸分布窄、波长覆盖范围广。此外，Reiss等人在Peng的基础上以CdO为前体在HDA-TOPO混合体系中合成CdSe，然后以硬脂酸锌为锌源，在CdSe的表面包覆一层ZnSe，首次合成了CdSe/ZnSe核壳结构的量子点，荧光量子产率高达85%。另外，也有研究者采用在水溶液中进行量子点的合成，Weller等人以六偏磷酸钠及巯基乙酸、巯基乙胺等巯基化合物为稳定剂，以Cd(ClO4)2?6H2O为镉源合成了水溶性的CdS、CdSe、CdTe量子点。该法操作简单、可制备的量子点种类多、所用材料价格低、毒性小，且量子点表面修饰有可直接与生物分子偶连的羧基或氨基等官能团。然而，采用在水溶液中合成量子点的方法存在着量子产率不高、尺寸分布较宽等缺点。所以，目前人们仍较多的采用在有机体系中进行量子
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
荧光探针在蛋白质研究中的应用
第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用 Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮 (中国科技大学化学系 合肥230026) 大学化学 摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。利用它可以测定蛋白 质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。 一、 引言 荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离 子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ )等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。 二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征 1. 有机荧光探针的某些特征 最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3 N θH θθSO -3N H θ H 3C θθS O O Cl N H 3C CH 3 1,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl 图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构 这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极 Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对定量方法实际操作 （三种常用方法） 本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看对照组目的 基因平均Ct 对照组看家 — 待检样品目 ——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例：
Taqman设计总结
一、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实一次） 1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前 ①长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。 ② TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃）， 最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守片段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。 ③探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp（一 般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 ④5'端应避免使用碱基G，5' G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还 会存在；如果选择FAM-dye在5'端第二个序列也不能为G（G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal）。 ⑤可选：整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，G的含量多于C会降 低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。 ⑥Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免4 个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe. Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in the
荧光探针的发展和应用
Supplementary materials for: Perylene diimide based “turn-on” fluorescence sensor for detection of Pd2+ in mixed aqueous media Hai-xia Wang a, b,*, Yue-he Lang a, Hui-xuan Wang a, Jing-jing Lou a, Hai-ming Guo a, b, Xi-you Li c,* a School of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Green Chemical Media and Reactions of Ministry of Education, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China b School of Environmental Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China email: hxwang5270@https://www.360docs.net/doc/df15836466.html, (H. Wang) c School of Chemistry an d Chemical Engineering, Shandong University, Jinan 250100, China email: xiyouli@https://www.360docs.net/doc/df15836466.html, (X. Li) Contents Page S1: Title of the paper, authors along with the contents. Page S2-S4: Copy of the 1H and 13C NMR spectra of PDI-1, PDI-2 and PDI-3. Page S5:Photophysical properties of PDI-1, PDI-2and PDI-3derivatives in different solvents at room temperature; Fluorescence spectra change of PDI-2and PDI-3 upon addition of different metal(8.0 equiv) ions; UV-vis spectra of PDI-1 (6.0 μM) in the presence of different metal ions (8.0 equiv). Page S6: Job’s plots in DMF/H2O (v/v, 7/1) and acetonitrile; Fluorescence spectra changes of PDI-1 (5.0 μM) in the presence of Pd2+in acetonitrile and chloroform;ESI mass spectra of PDI-1 in the presence of 1.0 equiv PdCl2 in CH3CN. Page S7: Job’s plots of PDI-1 (5.0 μM)in the presence of Pd2+in chloroform; Influence of pH on fluorescence intensity of PDI-1 (5.0 μM) in the absence and presence of 1.0 eq Pd2+; Benesi-Hildebrand analysis results.