11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选

11种植物提取物对4种病原细菌的抑菌活性筛选

植物源杀菌剂具有选择性高、环境友好、对非靶标生物安全、低毒、低残留等优点，从植物中寻找抑菌活性物质，是研发新型杀菌剂的热点之一。目前，中国开发与应用的植物源杀菌剂主要有苦参碱、黄岑苷、小檗碱、丁子香酚、香芹酚、儿茶素、大蒜素、乙蒜素、大黄素甲醚等。但前述产品多集中于对植物真菌病害的防治，对植物源杀细菌剂的研究大多侧重于食品污染菌的控制，且大多数还处于室内筛选阶段。魏希颖等研究发现泡桐花提取液对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用。叶舟测定了木麻黄（Casuarina equisetifolia Forst）小枝提取液的抑菌活性，发现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制活性。崔彦等的研究证明五倍子、丁香、地榆对黄瓜细菌角斑病菌表现出显著的抑制作用，其中五倍子提取物的活體防效可达60%，具有一定的开发潜力。李玉玲发现竹焦油对甘蓝黑腐病菌、番茄细菌性斑点病菌、茄青枯病菌等多种供试细菌都有不同程度的抑制活性。为了获得对植物细菌病害有广泛抑菌谱的植物源物质，本研究选取已报道过的具有广泛抑菌活性的11种植物提取物，对魔芋软腐病菌、猕猴桃溃疡病菌、核桃黑斑病菌、白菜软腐病菌4种常见的病原细菌进行室内抑菌活性筛选，旨在为新型植物源杀细菌剂的开发研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种魔芋软腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）、猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）、白菜软腐病菌（Erwinia carotorora）均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）由西北农林

科技大学林学院提供。

1.1.2 供试植物源物质及试剂大黄提取物（其中大黄素含量为0.30%）、博落回提取物（其中血根碱含量为0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量为1.90%）、皂荚提取物（其中皂荚素含量为6.90%）、苦参提取物（其中苦参碱含量为

2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗碱、蛇床提取物（其中蛇床子素的含量为10%）、藜芦生物碱（其中藜芦胺含量为2.30%）、98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的柠檬酸铜均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。72%的农用链霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。丙酮、葡萄糖、琼脂粉、氯化纳、胰蛋白胨、酒精、牛肉膏、酵母粉均购于陕西天成化玻有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制方法室内生测用于细菌性病原菌的培养与保存的固体培养基（NA）：称取琼脂粉15 g、

蛋白胨5 g、牛肉膏3 g，加水至1 L，灭菌锅灭菌待用；用于活化细菌性病原菌菌株的液体培养液（LB）：称取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠3 g，加水至1 L，灭菌锅灭菌待用。

1.2.2 药剂配制采用对供试病菌没有抑菌作用的丙酮作为溶剂，将供试植物源物质溶解。用20%丙酮-水溶液将各植物源提取物或化合物按其有效成分含量溶解稀释成2 000 μg/mL药液（作为母液备用）。用无菌水将各母液分别依次2倍稀释最终确定为1 000、500、250 、125、62.5 μg/mL 5个浓度梯度处理，均以浓度为200 μg/mL的72%农用链霉素作药剂对照，采用对供试细菌没有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作为空白对照，每个处理重复3次，以减少

误差。

1.2.3 供试菌种的准备将供试菌种在试验前1 d转接到LB培养液中，置于28 ℃恒温摇床箱中活化12 h。用无菌水调配成菌液浓度为1×106 CFU/mL，以供室内抑菌活性筛选使用。

1.2.4 琼脂扩散法室内抑菌活性筛选方法采用琼脂扩散法进行室内抑菌活性筛选，将溶化的营养琼脂培养基冷却至45～50 ℃，加入活化好的细菌数量大于106 CFU/mL的供试菌悬液摇匀（成带菌培养基）。每次取15 mL的带菌培养基，分别倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中，制成带菌平板。待冷却后用直径为9 mm的打孔器在平板上均匀打3个孔，并用接种针挑出孔中培养基，在每孔内加入75 μL配好的供试植物源物质，以200 μg/mL的农用链霉素作为药剂对照，并以丙酮作为溶剂对照，每组处理重复3次。置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察结果，用直尺按十字交叉法测量抑菌圈直径（减去孔径9 mm）求取平均值，进行比较。

1.2.5 最低有效抑制浓度（MIC）的测定方法采用二倍稀释法测定待测植物源物质的MIC值，取编号为1～11的试管以及适量的蒸馏水，放入灭菌锅里灭菌待用。灭菌完成后，取无菌试管，分别往试管内加入2 mL无菌水。将2 mL 浓度为2 000 μg/mL待测药液加入1号试管中，摇匀后，将混合后的药液2 mL 加入2号试管中，依次操作到10號管为止，弃掉10号管中的2 mL药液，使各个试管中的药液体积一样，将11号管设为空白对照，加入同等含量丙酮的水溶液。每种病菌设3组重复处理。最后将稀释好的细菌数量达104 CFU/mL的病原菌菌悬液2 mL分别加入1～11号试管中，置于适宜的温度培养箱中培养，待空白对照试管菌液出现浑浊，观察结果，进行比较。结果判断：由于菌液与药

液等量混合，相当于将药液二倍稀释，最终待测药液为10个浓度梯度，分别为500、250、125、62.5、31.3、15.6 、7.8、3.9、1.8、0.9 μg/mL。

结果观察：通过肉眼比对发现试管内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生，则此试管对应的药液浓度即为此药剂对待测病菌的MIC值。

1.3 数据分析

利用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 11种植物提取物对4种病原细菌的室内抑菌活性筛选

2.1.1 魔芋软腐病菌的室内抑菌活性筛选采用琼脂扩散法测定了11种植物提取物对魔芋软腐病菌的抑制活性，结果表明，供试11种植物提取物对魔芋软腐病菌的抑制效果有明显的差异。大黄、狼毒、博落回提取物、小檗碱、肉桂酸和藜芦生物碱6种植物提取物对魔芋软腐病菌均有不同程度的抑制作用（表1），皂荚、苦参、蛇床提取物及丁香酚、柠檬酸铜对魔芋软腐病菌则无明显抑制效果。由表1可看出，博落回提取物对魔芋软腐病菌的抑制作用最强，浓度在1 000 μg/mL时，抑菌圈直径最高达（19.3±0.30）mm；其次是大黄、狼毒提取物，抑菌圈直径分别为（17.3±0.48）、（11.9±0.26）mm，均高于或相当于对照药剂农用链霉素200 μg/mL的抑菌圈直径（12.6±0.26）mm；同时，小檗碱、藜芦生物碱的抑菌圈直径也达到了（10.0±0.26）、（10.1±0.34）mm，对魔芋软腐病抑制作用较好；肉桂酸仅有微弱抑菌活性，其1 000 ?g/mL处理抑菌直径仅（0.3±0.10）mm。

2.1.2 猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌活性筛选通过对猕猴桃溃疡病菌的室内活性筛选结果表明（表2），在浓度为1 000 μg/mL时，大黄和狼毒提取物抑