氧化低密度脂蛋白定量测定试剂盒说明书

氧化低密度脂蛋白定量测定试剂盒（酶联免疫法）说明书【产品名称】

通用名称：氧化低密度脂蛋白定量测定试剂盒（酶联免疫法）

商品名称：氧化低密度脂蛋白定量测定试剂盒（酶联免疫法）

英文名称：Requirement for Oxidized Low Density Lipoprotein Detection Kit （ELISA）

【包装规格】

96人份/盒；48人份/盒。

【预期用途】

本品为体外定量检测血液中氧化低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，OxLDL）含量的试剂。

【检验原理】

本试验采用双抗体夹心直接酶联免疫法。用抗人OxLDL抗体预包被微孔板，使样品中的OxLDL与固相化在微孔板上的抗人OxLDL抗体结合后，将未反应的组分洗脱，再加入酶标记抗体进行酶底物显色，在450nm波长下测定光吸收值，并根据在同一微孔板内反应的校准品制作的剂量-反应曲线，求得样品中OxLDL的含量。

【主要组成成份】

见表1。

表1 本试剂盒主要组成成份

编号组成规格数量

1 固相抗体微孔板96孔/ 48孔1块

2 OxLDL校准品0，1，2，4，8，16U/ml 各1瓶

3 质控物高、低各1瓶

4 酶标记抗体100μl1支

5 浓缩洗涤液（21×）30ml 1瓶

6 浓缩稀释液（5×）10ml 1瓶

7 样品反应液12ml 1瓶

8 底物液A 6ml 1瓶

9 底物液B 6ml 1瓶

10 终止液6ml 1瓶

【储存条件及有效期】

1、储存条件：2~8℃避光保存。

2、有效期：12个月。

3、试剂复溶及开瓶/开袋后储存条件及有效期见表2。

表2 试剂盒组份复溶、配制及开瓶/开袋后储存条件及有效期

组份效期及储存条件固相抗体微孔板（开袋后未使用板条）1个月，2~8℃，于封口的铝箔袋中OxLDL校准品（复溶后）1周，2~8℃

质控物（复溶后）1周，2~8℃

酶标记抗体（稀释后）1天，2~8℃，避光

洗涤液（1×）1个月，2~8℃

稀释液（1×）1个月，2~8℃

底物液（配制后）新鲜配制后使用

酶标记抗体（未稀释）12个月，2~8℃，避光洗涤液、稀释液（未稀释）12个月，2~8℃

底物液A、B 12个月，2~8℃

样品反应液、终止液12个月，2~8℃

【适用仪器】

1、带有单波长检测能力的酶标仪，有450nm滤光片，增益应小于20。

2、微孔板清洗器。

【样本要求】

采集禁食12小时后空腹血，分离血浆或血清。如采用血浆样本建议使用EDTA抗凝血浆。样品在2~8℃可存放一周。由于冻融对检测结果影响较大，故待测样品不能冻存。严重溶血和微生物污染的样本不能使用。

【检验方法】

1.试剂配制：

(1) 测定前10分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

(2) 将10ml浓缩稀释液（5×）用40ml纯化水稀释至1×。

(3) 将30ml浓缩洗涤液（21×）用600ml纯化水稀释至1×。

(4) 校准品的复溶：在OxLDL校准品（0、1、2、4、8、16U/ml）及高、低质控物中分别加入1ml纯化水进行复溶，静置3分钟，摇匀。

(5) 酶标记抗体工作液：取适量酶标记抗体，用稀释液做125倍稀释，如取80μl酶标记抗体，加入9920μl稀释液，混匀。

(6) 底物液：取等体积的底物液A和底物液B，充分混匀，临用前配制，如取5ml底物液A加5ml底物液B。

2. 洗板方法：

(1) 自动洗板：要求每孔注入洗涤液350μl，注入与吸出间隔15~30秒。

(2) 手工洗板：倾去孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静止30秒后倾去洗涤液，在吸水纸上拍干。

3．测定步骤：

(1) 稀释样品：用稀释液将样品稀释4倍。

(2) 准备微孔板：撕开密封袋，取出微孔板，去除封板胶纸，用洗涤液洗涤3次，备用。

(3) 加样：将校准品、质控物和待测样品加入微孔板，25μl/孔，再加入反应液，100μl/孔，37℃下孵育2小时。

可参考表3所示加样顺序进行加样。

表3 加样顺序示例

孔样品孔样品

1A-B 校准品0 U/ml 3A-B 待测样品

1C-D 校准品1 U/ml 3C-D 待测样品

1E-F 校准品2 U/ml 3E-F 待测样品

1G-H 校准品4 U/ml 3G-H 待测样品

2A-B 校准品8 U/ml 4A-B 待测样品

2C-D 校准品16U/ml 4C-D 待测样品

2E-F 质控物（低）4E-F 待测样品

2G-H 质控物（高）4G-H 待测样品

(4) 洗板5次。

(5) 加入酶标记抗体工作液，100μl/孔，37℃下孵育1小时。

(6) 洗板5次。

(7) 加入底物液，100μl/孔，37℃下避光孵育15分钟。

(8) 加入终止液，50μl/孔。

(9) 测定光吸收值：启动酶标仪，于终止反应后30分钟内读数，测定波长450nm。

4. 试验过程中应注意：

(1) 严格控制反应时间。

(2) 在加入试剂时应沿着孔壁加入，以免外溅。

(3) 配好的底物液要避光。

(4) 酶标记物含有甘油，较粘稠，要小心加入以确保结果精确。

5．质量控制：

每个微孔板上至少采用两个浓度的质控物进行质量控制，以确保每个微孔板测定结果的可靠性。

(1) 0U/ml校准品的光吸收值应≤0.3。

(2) 质控物的测定值在允许范围内。

(3) 重复样本的测定结果变异系数在15%以内。

如不能同时满足上述条件，则该试验结果无效，需重新进行测定。

6. 测定结果的计算

(1) 计算每个校准品、质控物和样品的平均吸光值。

(2) 以0U/ml的校准品为空白对照，校准品、质控物和样品的光吸收值应减去空白对照的光吸收值。

(3) 使用对数线性图纸，以校准品浓度的对数为横轴，光吸收值的对数为纵轴，绘制OxLDL 浓度-光吸收值双对数剂量-反应曲线。

(4) 根据稀释的待测样品光吸收值从剂量-反应曲线上查出稀释样品的OxLDL浓度。

(5) 样品中OxLDL的最终浓度等于稀释样品的浓度乘以稀释倍数。

(6) 如果样品的光吸收值高于16U/ml或低于1U/ml校准品的光吸收值，可适当延长曲线进行计算，外推因子（Extrapolation Factor）不超过2。

(7) 本公司使用BioTek EL800型酶标仪配套的KC4（V ersion #2.0，Rev #17）数据分析系统对试验结果进行分析。范例如下所示：

表4 校准品和样品测定结果

复孔光吸收值平均光吸收值OxLDL浓度校准品0 0.078 0.079 0U/ml

0.080

校准品1 0.206 0.210 1 U/ml

0.214

校准品2 0.322 0.320 2 U/ml

0.318

校准品3 0.513 0.521 4U/ml

0.529

校准品4 0.917 0.888 8 U/ml

0.859

校准品5 1.542 1.563 16U/ml

1.584