植物脱毒技术2---无病毒植物检测的方法电子教案

植物脱毒技术
一、授课章节
植物脱毒技术2---无病毒植物检测的方法。

二、学时安排
2学时。

三、教学目标
1．了解无病毒植物检测的方法。

四、教学重点、难点分析
重点：
检测方法。

难点：
检测。

五、教具
电化教学设备, 试管苗。

六、教学方法
讲授法，演示法。

七、教学过程
Ⅰ导入
植物脱毒的病毒病仅次于真菌类病害，对农业生产造成了巨大的损失，如何通过一些技术手段来达到去除植物体内病毒，恢复种性或进行生产，这就是植物脱毒技术。

II新课
三、无病毒植物的检测
（一）直观检测法
对于非潜隐性病毒，可以直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状特征，这是一种最简便的方法，然而对于潜隐性病毒就需要更敏感的测定方法。

（二）指示植物检测法
指示植物检测是利用病毒在植物体上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的依据，也叫枯斑测定法。

这种专门用以产生局部病斑的寄主称为指示植物，又称鉴别寄主。

1.检测方法
●汁液涂抹法：从待测植物中取1～3g幼叶置研钵中→加入少量水及等量的0.1 mol／L磷酸缓冲液(pH为7.0)→磨成匀浆→用棉球蘸少量浆液和500～600目金刚砂→在指示植物叶片上轻轻涂抹（以使浆液能浸入叶片表皮细胞但又不损伤叶片为度）→约5min后用清水冲洗叶面→将被接种的指示植物置于防蚜虫网室(15～25℃)内培养。

如接种的浆液内含有病毒，经数天至几周后指示植物即出现可见的症状。

此法主要用于草本植物和通过汁液传播的病毒的鉴定。

比较常用的指示植物有荆芥、昆诺阿藜、千日红和各种烟草等。

●嫁接法：适用于木本多年生果树和草莓、甘薯等无性繁殖的草本植物，采用汁液接种法比较困难，通常采用嫁接接种的方法，以指示植物作砧木，被检测植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接。

2.对指示植物的要求
●应根据不同的病毒选择适合的指示植物；
●所选指示植物一年四季都容易栽培；
●能够在较长时期内保持对病毒的敏感性；
●容易接种；
●较广的范围内具有同样的反映。

指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其出现在病毒扩展到的植物非接种部位，通常没有局部病斑明显；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑构成。

3.指示植物检测法的优缺点
(1)优点：条件简单，操作方便，是一种经济有效的检测方法，所以大多数植物检测用指示植物检测法。

(2)缺点：不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。

（三）抗血清检测法
植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白体，是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体。

抗原和抗体结合产生沉淀的反应即为血清反应（免疫反应）。

抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，含有抗体的血清即称为抗血清。

由于不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，因此抗血清在病毒的检测中成为一种高度专化性的试剂，其特异性高，检测速度快，一般几小时甚至几分钟可以完成。

1.检测方法
●抗原的制备：病毒的接种繁殖→病叶的研磨→病毒的提纯。

●抗血清的制备：动物的选择和饲养→抗原的注射→抗血清的采集（采血）→抗血清的分离→抗血清的保藏。

●抗血清检测（免疫反应）：有叶绿体凝聚法、块茎沉淀法、环形接口法、酶联免疫法等方法。

2.抗血清检测法的优缺点
(1)优点：特异性强，灵敏度高；操作简便、安全、快速；无需特殊仪器设备，结果容易判断；可同时检测大量的样品。

(2)缺点：抗血清来源困难，成本高，常规检测应用较少。

（四）电子显微镜检查法
病毒颗粒一般小于0.1um的微粒，人的眼睛观察不到，光学显微镜仅观察200nm的微粒，而电子显微镜则将分辨能力增大至0.5nm。

通过电子显微镜在病毒的薄样品或部分纯化的病毒悬浮液中容易观察到。

采用电子显微镜法鉴定病毒，直接观察有无病毒颗粒存在，并观察有关病毒颗粒大小、形状和结构，由于这些特征稳定，对病毒鉴定有很大的作用。

这种检测方法，需要一定的设备，常规检测应用较少。