基因芯片及其在植物病原物检测中的应用

基因芯片及其在植物病原物检测中的应用

摘要:基因芯片是近年来发展起来的一项新兴技术，是把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵，在基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等方面起着重要的作用。基因芯片技术已广泛应用于病原物检测，在植物病害预测和防治中起着重要的作用。

关键词:基因芯片; 病原物检测

1996年，美国Affvmetrix生物公司制造出世界上第一块商业化的基因芯片(Gene chips)，由此掀起了基因芯片研究热潮。基因芯片被迅速而广泛地应用于生命科学与医学的各领域，被誉为继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命[1]。随着基因芯片技术的不断发展，其在生命科学和医学中的研究领域中的应用几乎是全方位的，包括基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等［2］。本文仅叙述基因芯片原理已经基因芯片在植物病原物检测中的作用。

基因芯片的基本原理

基因芯片，又称DNA芯片(DNA chips)，属于生物芯片(bio-chip)中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片［3］。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术:将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点［4］。

基因芯片技术的四个技术环节

芯片的制备

主要是原位合成法和直接点样法。原位合成法适用于寡核苷酸；点样法多用于大片段，有时也用于寡核苷酸。原位合成法包括光导合成法和压电合成法。其优点是反应量大，探针的密度高并且可以和其他芯片制备方法结合使用，该方法的缺点是探针的长度较短，一般为20-50bp。点样法包括接触式点样和非接触式点样又称喷墨式打印。因点样法成本高，故适用于芯片上需要同一探针或是探针是长链DNA。

样品制备与标记

从待检细胞或组织中分离出DAN或RNA，经逆转录、PCR扩增、末端标记等操作，标记主要有荧光标记，生物素或同位素标记、现在常用荧光素标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。

杂交反应

属于固－液相反相杂交，探针分子固定于芯片表面，与液相的靶分子进行反应。但杂交条件的选择需考虑多方面的因素，如杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。由于基因芯片影响因素很多，所以要合理设置异种核酸平行实验、核酸质量、检测对照、封闭对照、归整化对照，以保证结果的准确性和重复性。信号检测和分析

常用的荧光标记法使用激光共聚集荧光扫描仪进行信号检测。激光共聚焦扫描仪的激光光源可产生激发不同荧光染料的光，当探针与待测核酸完全正常配对时的荧光信号强度是具有单个或2个错配碱基探针的5~35倍，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。新发展的纳米金标记，通过银放大后可直接用肉眼观察，具有非常好的灵敏度（超过荧光标记法100倍）和特异性。

基因芯片在植物病毒检测中的应用

目前对植物病毒的检测、鉴定虽然有一些方法，如电镜、ELISA、PCR技术等，但每次试验只能针对1种病原菌进行检测。近年来发展的基因芯片技术是一种高效、快速并可同时测定基因组成千上万个基因活动的新方法，该技术的原理是将大量DNA探针片段有序地固化于支持物表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，从而识别样品中存在的特异性核酸序列［5］。它最大的优点在于高通量、并行化和微型化，在基因芯片上，单位面积可以高密度排列大量的生物探针，1次试验就可以同时分析多种生物靶点，其效率远远高于传统检测手段。

基因芯片检测技术在植物病毒检测中也有很多探索和应用:Lee等［6］设计了一种芯片可以检测和区别4种感染葫芦科植物的烟草花叶病毒组成员，Abdullah 等［7］应用该技术成功检测了马铃薯A病毒(PV A)等12种病毒，马新颖等［8］建立了黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、木槿褪绿环斑病毒等10种植物病毒的基因芯片检测方法。本研究结合RT-PCR，制备了用于检测CMV、TMV和PVY 3种植物病毒的基因芯片，以期为病毒病的防治提供一种简单、快速、准确的理想方法。

基因芯片在黄单胞菌检测中的应用

目前对黄单胞菌的分子生物学检测大多基于PCR技术。这些方法存在易污染、灵敏度低,而且每次只能检测一种致病菌等不足。基因芯片技术是近年发展起来的高新生物技术,可以对多种靶基因同时检测和鉴定,以其高通量、快速、多靶标等优势得到广泛的应用[9]。

龙海[10]等结合双重PCR和基因芯片技术同时检测和鉴定我国检疫性细菌,包括水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)、水稻细菌性条斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola,Xooc)、柑桔溃疡病菌(X.axonopodispv.citri,Xac)以及严重危害十字花科作物的甘蓝黑腐病菌(Xanthomonas campestrispv.campestris,Xcc)。以铁载体受体(Putative siderophore receptor)基因序列和RNA多聚酶西格玛因子(RNA polymerase sigma factor, rpoD)基因序列为靶标,设计引物和特异性探针能够

同时检测这4种重要的病原菌。对17个细菌菌株进行芯片检测,仅4种靶标菌得到阳性结果,证明此方法具有很高的特异性。4种致病菌基因组DNA的检测灵敏度约为3 pg。

基因芯片在植原体检测中的应用

植物植原体(phytoplasma)病害是一类危害严重的植物病害,其侵染性强,危害寄主广泛,曾造成许多经济作物、林木的大量死亡,带来严重的经济损失,如我国发生的泡桐丛枝病、枣疯病就是典型的例子。目前世界各地先后报道的植原体病害达700多种,我国也报道了100余种。因而及早发现感病植物中植原体的存在,及早采取相应的措施,将带毒植物予以铲除,杜绝侵染来源,对该类病害的防治具有重要意义。

但由于植原体在体外不能人工培养,长期以来主要依靠生物学、电镜观察、抗生素试验相结合的传统方法进行检测。自80年代以来,出现了血清学检测和多种分子生物学检测方法,主要有基于16S rRNA、23S rRNA以及核糖体蛋白基因rp序列的分析,建立限制性片段长度多态性分析(RFLP)、核酸杂交、PCR等检测方法。随着上述检测方法的不断改进,其准确性、灵敏性均有所提高。但这些方法大多都难以实现高通量检测。近年来,基因芯片检测技术已用于检测植物植原体。罗焕亮[11]等通过分析比对11种检疫性植原体的16S rDNA序列,设计了通用引物以及种间特异性探针,并建立了植原体基因芯片检测技术,实现了高通量检测植原体病原,提升了检疫鉴定植原体的速度。