真菌染色

最近在看关于真菌的染色方面的资料，现在总结一下发出来，大家共同学习一下。

一、背景介绍

真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件．近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。

真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。

深部真菌：指侵犯表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌.；按生物学性状的不同又分为：酵母型、酵母样型、丝状菌型、双相型。深部真菌常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌,马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌,孢子菌丝等。

真菌的形态分单细胞和多细胞两种类型，单细胞真菌呈圆形或卵圆性，常见于酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌多呈丝状，分枝交织成团，也称为丝状菌，即一般通称为霉菌。由菌丝和孢子构成。孢子是真菌的生殖结构，分为有性孢子和无性孢子。在适宜条件下，菌丝是由孢子生出芽管，逐渐延长呈丝状，生物学上把真菌的每一根细丝叫做菌丝。

二、常用检查方法

1、直接镜检：直接镜检的方法方便经济，可采用不染色的湿片如KOH涂片或乳酸酚棉蓝涂片。对浅表和皮下真菌感染最有帮助，一般在有菌部位发现大量真菌菌丝即可作出诊断，可在几分钟内完成，并且观察到的真菌形态可以提供有价值的临床信息。但是缺点在于阳性率较低，隐形结果也不能排除诊断。

2、真菌的染色方法：

①革兰染色：所有真菌真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织胞浆菌及诺卡菌放线菌的感染。

②吉姆萨染色可用于骨髓涂片和其他标本中荚膜组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。用吉姆萨染色必须要有指控涂片。

③PAS法：用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基，后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色。

操作方法：

(1)切片脱蜡至水。

(2)0.5%高碘酸氧化5-8分钟。

(3)流水冲洗2分钟，再用蒸馏水洗。

(4)入无色品红液于暗处并加盖作用10-20分钟。

(5)0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1分钟。

(6)流水冲洗5分钟。

(7)0.2%亮绿水溶液复染。

(8)稍水洗。

(9)常规脱水透明封片．

染色结果：

真菌菌丝和孢子呈品红色，其他组织绿色

P.S：

无色品红液(Schiff氏试剂)的试剂配制主要是试剂的纯度要高，才能配制出理想的无色品红液，染色才能成功。

④六胺银法（GMS）:用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。

操作方法：

⑴切片脱蜡至水。

⑵8%铬酸水溶液氧化20分钟，自来水稍洗。

⑶0.5%偏重亚硫酸钠液处理1分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗2次。

⑷浸入已预热（约15-30分钟）的六胺银工作液中分三种方式处理：

①水浴锅内恒温处理（50-52℃）：先将已盛有六胺银工作液的5片装高身染色缸置入水浴锅内预热15-30分钟，再将处理好的玻片置入六胺银工作液中反应30-60分钟，中途显微镜观察，至见到菌丝呈黑褐色为止。

②电热恒温箱内处理（58℃-60℃）：方法同上，在六胺银工作液中反应的时间较长需60-90分钟, 蒸馏水稍洗.

③微波炉滴染：取微波炉专用蒸盒，底放50ml水，用于吸热保湿；玻片放置隔层，滴加六胺银工作液于组织上，火力3档5-6分钟,蒸馏水稍洗.

⑸滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟,蒸馏水洗。

⑹3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟, 流水冲洗5分钟。

⑺用橙黄G复染1-2秒（首选）或用Mayer氏苏木素浅染，伊红复染。

⑻常规脱水透明封片。

2．染色结果：

各种真菌均被着色，菌丝和孢子呈明显的黑褐色。背景为：橙黄色（橙黄G复染），红色（伊红复染）。

P.S：

六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，为了获得菌体及背景清晰的染色效果，首先必须做好准备工作，染色过程需用的玻璃器皿要洁净，尽量避免使用过久的蒸馏水配制试剂，建议使用双蒸水，这样才能保证六胺银工作液的纯度，避免杂质沉淀影响观察。其次病理技术人员应掌握常见真菌的一般形态特征，并根据实验室的具体情况选择合适的孵育条件，摸索孵育时间和温度。在显微镜下观察染色程度时，低倍镜下颜色不要太黑，至深棕褐色即可，经0.1%氯化金溶液调色后，真菌从深棕褐色变成棕黑色，真菌壁和孢子着色。

如若过染可用1%铁氰化钾与2%硫代硫酸钠1:1混合备用，临用时将此混合液再稀释2-3倍，滴入玻片上使组织减色，镜下观察

⑤银氨液浸染法（G-S）：

操作方法：

(1) 切片脱蜡至水

(2) 切片滴入0.5%酸化高锰酸钾液，氧化5分钟，稍水洗。

(3) 2%草酸水溶液漂白1-2分钟，稍水洗。

(4) 2%硫酸铁铵水溶液媒染5分钟，再用蒸馏水洗一次。

(5) 滴入G-S氏银氨液作用10-30秒，蒸馏水稍洗。

(6) 10%中性甲醛液还原30秒，流水冲洗数分钟。

(7) 滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟（镜下观察），水稍洗。

(8) 3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟（镜下观察），流水冲洗5-10分钟。

(9) 核固红液复染5-10分钟，稍水洗，常规脱水透明封片。

2.染色结果：

网状纤维及真菌呈棕黑色，胞核红色（核固红复染），胶原纤维黄棕色，胞质淡红色（伊红复染）。

P.S：

⑴配制银氨液的蒸溜水要纯，滴入银氨液作用不要超过1分钟，最好控制在10-30秒已足。

⑵10%中性甲醛还原不要超过1分钟，最好控制在30秒，否则容易出现银氨沉淀，影响观察。

⑥Gridley染色：此种方法菌丝或酵母染成暗蓝或玫瑰红色，组织深蓝，背景黄色。

⑦粘蛋白卡红（Mayer’s Mucicarmin stain）染色：此种特殊染色方法可把组织中的新生隐球菌染成鲜红色。

⑧巴氏染色法：巴氏涂片染色，特别是痰涂片，可以很好的区别双相真菌，机会性真菌，如烟曲霉等就很容易着色。

以上就是目前较常用的临床上真菌染色的方法，其中，六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，并且能显示另外两种方法所不能显示的真菌结构，对真菌病的诊断具有确诊的价值。

下附各种真菌的镜下大致形态：

1．新形隐球菌在镜下多呈圆形，直径为4-20微米，菌体周围有一层宽阔的具有折光性的胶质样荚膜包绕，荚膜厚3-5微米，为一种粘多糖物质所组成，爱先蓝染色和粘液胭脂红染色呈阳性反应。六胺银染色也能很好地显示菌体的特征，但必须掌握染色程度，显色太浅，隐球菌的夹膜不明显，显色太深，则分不清夹膜和菌体。

2．组织胞浆菌病的感染途径是通过吸入荚膜型组织胞浆菌的分生孢子后感染所致的全身性真菌病，主要侵犯机体的网状内皮系统。组织胞浆菌病是一种典型的双相性真菌，在人体组织中是酵母型，大部分病变中均可在巨噬细胞内找到很多的病原菌。HE染色见菌体为小圆形或卵圆形，直径很小只有1-5um，有明显的细胞壁。PAS染色（首选）菌细胞壁阳性。六胺银染色也能清晰的见到病原菌，菌细胞壁呈黑色。

3．马尔尼菲青霉菌是较罕见的真菌病，是已知唯一的双相性青霉菌，该菌在人体组织中酷似组织胞浆菌，其镜下是一种2.5-3微米的圆形或椭圆形酵母细胞，它所具有的特征性标志是腊肠形分隔的孢子。本病易与组织胞浆菌混淆：（1）组织胞浆菌在组织胞浆内呈淡蓝色核点，周围有空晕，但无“腊肠”状菌体、中部无横隔。

（2）马尔尼菲青霉菌有双相性，即在不同温度下培养呈不同形态。25℃培养呈灰褐色绒毛状菌落，培养基呈玫瑰红色，镜下为菌丝相；37℃培养呈灰褐色粗糙的酵母样菌落，镜下为酵母相。