病毒感染的实验室诊断

CA抗体IgG和IgM 阴性
未感染EBV
Ca抗体IgM阳性和低亲合力CA IgG抗 体，EA抗体IgG可能阳性 或 EBNA-1抗体IgM和p27抗体IgM 阳性 EA抗体IgG 阳性
EBNA-1抗体丢失
CA抗体IgM为阴性和高亲合力的CA IgG抗体
EA抗体IgG 阴性
EBNA-1抗体丢失
CA抗体IgG p22 阳性
PCR扩增靶DNA示意图
双链靶DNAபைடு நூலகம்
变性 退火 延伸
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
第二次循环
第三次循环
靶DNA
靶DNA
n次循环 靶DNA，(2n-2n)个拷贝
PCR反应步骤
预变性
退火
变性
延伸
PCR animation
常规PCR产物确认
荧光定量PCR
荧光定量PCR的标准曲线
＋
＋
＋
＋
＋
－
－
－
高
高
10（4.5％）
6（2.7％）
EBV抗体四项结果分析1
EBNA-1抗体 IgG 阳性
CA抗体IgG阳性和EA抗体IgG 阳性和/或CA抗体IgM阳性或 CA抗体IgA 强阳性
只是高亲合力的CA IgG抗体
复发
既往感染
EBV抗体四项结果分析2
EBNA-1抗体 IgG 阴性
CA抗体 IgG阳性
1980, non-Hodgkin’s lymphoma
EBV 相关疾病



传染性单核细胞增多症（Infectious mononucleosis，IM） 慢性活动性EB病毒感染（Chronic active EBV infection，CAEBV） EB病毒相关性嗜血细胞综合征（EBVassociated hemophagocytic syndrome, EBVAHS)
三、病毒分离结果

敏感性较低 结合临床病程、症状体征和标本来源综 合判定： 1、阳性结果，是否与临床相符（SARS 与衣原体） 2、阴性结果，是否病程已过急性期
儿童手足口病患者病原检测
原发性EBV感染的诊断
人类疱疹病毒
常用名 单纯疱疹V-1型 单纯疱疹V-2型 水痘-带状疱疹 EBV CMV 人疱疹V6型 人疱疹V7型 正式命名 人疱疹V1型 人疱疹V2型 人疱疹V3型 人疱疹V4型 人疱疹V5型 人疱疹V6型 人疱疹V7型 所属亚科 生物学特性 在感染N节中潜伏 在感染N节中潜伏 在感染N节中潜伏 在淋巴细胞中潜伏 在淋巴细胞及分泌腺 体中潜伏 同上 同上
ELISA结果的判定



目测法：一般加底物后，肉眼下出现颜色的为阳 性，无色为阴性 临界值法：以标本OD值＞阴性对照平均OD值加 2-3个标准差作为阳性结果的阈值 S/N值法：以S/N值≥2.1为阳性， S/N值＜ 2.1而 ≥1.5为可疑， S/N值＜1.5为阴性
免疫荧光法
间接法和直接法 间接法 1）固定 2）冲洗 3）与第一抗体结合 4）与第二抗体及免疫荧光抗体结合 5）冲洗 6）封片、观察
亲合力检测
EBV-CA (IgG) 没用尿素处理 EBV-CA (IgG) 用尿素处理
早期
EBV-CA (IgM) EBV-EA (IgG)
晚期
EBNA (IgG)
Patient 1
新近感染
Patient 2
既往感染
原发性EBV感染的体液免疫
早期阶段
晚期阶段
抗体滴度
[周]
症状
[月] 病程
EBV感染的再激活
早期
恢复期
晚期
复发
抗体滴度
[周]
[月]
病程
CA (IgG) + EBNA (IgG) + CA (IgA, IgM)+ EA (IgG)+
体液免疫的特殊情况
5% 的EBV新近感染 抗CA抗（IgM）阴性 在罕见的病例中抗CA 抗体(IgM)会持续阳性
20-30% 的EBV新近感染 抗 EA抗体（IgG）阴性
人疱疹V8型
人疱疹V8型

同EBV
Epstein-Barr virus (EBV)
1964, discovered from Burkitt’s lymphoma tissue by Epstein, Achong, and Barr
Burkitt’s lymphoma in Kenya
1968, the etiologic agent for infectious mononucleosis 1970, nasopharyngeal carcinoma


一般情况下：一周左右升高，持续存在4～8周， 类风湿因子和IgG抗体可致结果假阳性 临床要注意以下情况： 1、有的病人抗EB病毒CA-IgM产生延迟 2、少部分病人感染EBV后，CA-IgM持续阴 性 3、也有的病人CA-IgM持续几个月阳性
抗体亲合力检测


机体在受到病原体入侵时首先产生低亲合力抗 体，随感染的继续和进展，抗体亲合力升高。 因此，低亲合力抗体的检出提示原发性急性感 染。 原发EBV感染，100％的病人在第一个月内可检 测到抗EB病毒CA-IgG低亲合力抗体
持续的IgM反应：如风疹、CMV等早期妊娠感 染或先天性感染的儿童，特异性IgM可能持续 达1年或更长时间 IgM型抗体阴性： 1）病程：风疹、出疹后第1天，45%能查到 IgM；麻疹、出疹后3天内，70%左右能查到 IgM 2）病人的免疫功能：免疫抑制病人
3）局部感染 4）隐性感染的再激活和再次感染（EBV、CMV 等人疱疹病毒）：产生的特异性的IgM少，应 查双份血清的特异性IgG ★多种病原体IgM抗体同时阳性 1、IgM持续时间 2、交叉反应：肠道病毒、黄病毒
病毒分离

标本接种于敏感细胞 观察细胞病变 病毒的鉴定：PCR，IF等
Cytopathic Effect
Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells .
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town)
EBV-IM的临床表现
其它： 1.间质性肺炎 2.CNS: 脑炎、格林－巴利综合征等 3.心肌炎 4.血液系统：溶血性贫血、再障、粒细胞减少 5.肾炎 6.关节炎 7.胰腺炎

EBV抗体四项

VCA-IgG VCA-IgM EA-IgG NA-IgG VCA-IgG亲合力
衣壳抗原（CA）－IgM
发热＞38OC，出现斑丘疹和至少伴 有以下一种症状：咳嗽，鼻炎或结 膜炎（WHO） HHV-6 Parvovirus B19 微小病毒B19 Rubella 风疹 Others 其它
内容

病毒感染的实验室诊断方法简介 检测的结果分析 EBV感染的血清学诊断
病毒感染的诊断方法简介
病毒感染的诊断类型及方法
类型
抗体检测 （IgG/IgM) 抗原检测 （蛋白质）
方法
ELISA, IF, EIA ELISA, IF,EIA
所需标本
血清，CSF 咽拭子，粪便, 血细胞图片，
临床意义
是否感染和感染 的大概时期 活动性感染
病毒核酸 （DNA/RNA）
病毒分离
PCR
细胞培养
体液和咽拭子
体液，咽拭子及 组织
感染
金标准，产毒性 感染

DEAFF test for CMV
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
PCR
一、PCR基本原理 PCR是一种快速和简便的DNA体外扩增技 术。在模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷三 磷酸存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行 聚合反应，经变性、退火及延伸三步骤多次循 环，对特定DNA模板进行扩增。PCR技术的特 异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

Typical Serological Profile After Acute Infection
Note that during reinfection, IgM may be absent or present at a low level transiently
检测IgM应注意的问题


病毒感染的实验室诊断
谢正德
首都医科大学附属北京儿童医院病毒研究室
病毒感染——实验室确诊的意义

2003年SARS爆发 2008年手足口病的流行 群体性发热 临床工作中病原的确定 及时准确的实验室确诊非常重要
Measles
麻疹
Echoviruses
Dengue
登革热
Echo病毒
麻疹可疑病例的临床诊断
检测结果的分析
一、血清中特异性IgG和IgM的意义

单份血清特异性IgG阳性，只能说明过去有过 病毒感染，而不能确定最近感染。只有在发病 初期检测不到抗体或滴度低，而恢复期抗体4 倍以上升高才有诊断意义。 测定单份血清中的特异性IgM抗体，有助于疾 病的早期快速诊断，但临床诊断中要结合病程、 临床表现和病毒类型综合考虑。
PCR的要求

目的基因的序列 设定引物 PCR实验要求的原料：引物、酶、dNTP、 Mg+、模板及缓冲液
PCR基本步骤
PCR一次循环包括三个基本步骤：
1.变性(denaturation)：加热至90~96º C，DNA 双链模板变成单链 2.退火(annealling): 缓慢降温至30-65 º ，引物 C 与单链DNA模板互补结合 3.延伸(extention): 升温至70~74º DNA链延伸 C, （需TaqDNA聚合酶，dNTP， Mg2+） 循环30次，特异DNA产量达230拷贝(约109)
抗EBNA抗体(IgG)阴性
220例IM病人血清中EBV抗体四项结果
抗体反应类型
VCA-IgG ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ VCA-IgM ＋ ＋ － － ＋ ＋ EA-IgG ＋ － ＋ － ＋ － NA-IgG － － － － ＋ ＋ VCA-IgG亲和力 低 低 低 低 低 低 例数（％） 150（68.2％） 36（16.4％） 7（3.2％） 2（0.9％） 8（3.6％） 1（0.5％）
二、PCR检测结果的分析

PCR检测阳性：并不一定说明是病原或 活动性感染，要结合临床、标本来源等 综合分析 可能是正常携带病毒或潜伏感染，如 肠道病毒，正常人粪便中可以检测到， 但脑脊液中检测阳性则有临床意义


CMV尿荧光定量PCR阳性不能用于判断 疗效和指导治疗，但血清中定量PCR与 病情严重程度相关 PCR检测阴性：要结合临床病程分析 呼吸道病毒感染、肠道病毒感染一般 7～10天后可能检测不到病毒核酸


伴性淋巴增殖综合征 （X-linked lymphoproliferative syndrom） 鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma） Burkitt’s 淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma） 何奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma）
CD21
Asymptomati c infection
EBV
B
MHC-II
gp350
Latent infection
Symptomatic infection（IM)
EBV-related other diseases
Primary EBV Infection
EBV-IM的临床表现




发热： 约1周，严重者2周或更久，幼儿可不 明显 淋巴结肿大：任何淋巴结，颈部最易受累 咽炎：50％有渗出物，25％上腭有瘀点 脾肿大：病程2～3周，50％出现 肝炎：肿大10％～15％，而GPT升高80％ 皮疹：红斑、斑丘疹或麻疹样疹，50％可有眼 睑浮肿
病毒感染的临床过程与诊断
细胞免疫 临 床 表 现 体液免疫
核酸检测/病毒分离 抗原检测 抗体检测 潜伏期 症状期 恢复期
康复 或死 亡
ELISA的原理


病毒抗原/抗体包被在固相载体表面 加入待检血清，→抗原抗-体复合物 洗涤，加入酶标记抗人免疫球蛋白，与抗原抗 体复合物特异性结合 洗涤，加入底物显色，测OD值
EBNA-1抗体丢失
原发感染
的复发
的既往感染
的既往感染
1
2
3
1
病程4天 外周血EBV抗体结果
4 说明：图1为VCA-IgG，阳性；图2为VCA-IgG，提示为低亲和力；
5
图3 为VCA-IgM，阴性；图4为EA-IgG，阴性；图5为NA-IgG，阴性
1
2
3
病程8天 外周血EBV抗体结果
4 说明：图1为VCA-IgG，阳性；图2为VCA-IgG，提示为低亲和力；