基因组学

1 Structural genomics and function
genomics
结构基因组学：经过基因作图、核苷酸分
析来确定基因的组成和基因定位。

功能基因组学：在结果基因组学所获得的
信息和产物的基础上，全面系统地分析基
因的功能。

2 orthologous and paralogous genes
直源基因：基因是那些不同种属生物间的
同源基因，它们的共同祖先早于种属分化。

旁源基因：基因存在于同种生物中，常识
多基因家族的成员，他们的祖先可能早于
或晚于种属分化。

4 Enhancer trap and promoter trap
增强子陷阱：将某报告基因与一个精巧的
启动子相连，组成一增强子陷阱重组体，
它不会自主起始转录，而需由被插入的细
胞基因组中的增强子帮助才可转录。

若报
告基因最终表达，则可推知插入位点附件
有增强子或有基因，即实现了以增强子陷
阱重组体发现增强子的目的。

启动子陷阱：通过将报告基因插入到细胞
基因组的外显子上，一旦发现它与细胞基
因组基因共同转录或表达，则可知该报告
基因附件有启动子，从而起到了以之为诱
饵发现启动子的目的。

5 Ac/Ds transposon and T-DNA insertion
T-DNA插入：农杆菌中细胞中分别含有Ti
质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆
菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将
T-DNA插入到植物基因组中。

Ac/Ds转座子：玉米中的一个转座子家族。

该家族的自主元件是Ac ,它包含和转座相
关的酶,能使Ac 、Ds 元件发生转座。

而Ds
是一种非自主元件,它单独不能发生转座,
可以利用Ac 的转座酶发生转座。

Ac/Ds 系
统的转座是通过剪切/粘贴的机制进行的。

请比较全基因组测序中克隆重叠群法
（clone by clone）和鸟枪法（shotgun
method）测序的优缺点。

鸟枪法：将分子打成片段，得到每个片段
的序列，然后应用计算机搜索重叠区并构
建主序列。

优点：测序速度快，并且不需要遗传或物
理图谱。

成本低，快速，易于自动化操作。

短期内完成大规模的基因组测序任务
缺点：从起始序列寻找重叠区域及构建序
列重叠群的复杂性和数据分析的限制。

另
外，因为不连续的序列可能因为重复单位
而被错误连接在一起，所以要求所研究的
基因组中没有或只有很少的重复序列。

主
要用于重复序列少、相对简单的原核生物
基因组，不适用于分析较大的、更复杂的
基因组。

克隆重叠群法：利用鸟枪法从基因组文库
中构建片段两端以测序的克隆文库（yac，
bac，pac等）然后结合引物步查法和亚克
隆法进行克隆片段的测序,再将这些已测序
的克隆片段组装成整条染色体或整基因
组，它也是建立在鸟枪法构建重叠群的基
础上，结合引物步查法和亚克隆发进行更
精细的测序，适用于基因组全长序列的精
细测定，
优点：完成的序列质量高。

缺点。

难以自动化分析，测序时间长。

成
本高。

一、请叙述功能基因基因组学的研究
目标，以及完成这些目标的方法。

研究目标：在结构基因组学所获得的信息
和产物的基础上，全面、系统地分析基因
的功能。

方法：1、利用计算机分析基因功能
计算机预测基因功能的依据仍然是同源
性比较。

根据同源性从数据库中查找已知
序列的同源基因。

根据进化的相关性，和
已知的同源基因推测新基因的功能。

2、用实验分析确定基因功能
（一）DNA水平：T-DNA标签（失活标签、活化标签）；基因、启动子、增强子陷阱；
转座子插入；TILING；自然突变等。

（二）RNA水平：反义RNA；RNAi；过
表达
基因失活是基因功能分析的主要手段
如果我们找到某种方法，使该基因在生物体内失活，就可以从反面鉴别该基因的功能。

基因剔除（knock-out）
将一段无关的DNA片段用来取代目标基因
是最简单的基因失活方法。

如果该基因所控制的表型变化了，就从反面验证了目标基因的功能。

基因的超表达用于功能检测
让基因过量表达，也能用于基因的功能检测。

有两种技术可以使细胞中某一基因过量表达：增加基因的拷贝数；采用强启动子。

反义RNA技术
反义RNA由基因的负链（模板链的互补链）编码，可以与由功能基因转录而成的正义RNA形成双链结构，干扰mRNA的翻译，从而干扰基因的表达。

分析表达的反义RNA在生理生化或形态发生中所起的作用，由此判别目标基因的功能。

转座子插入突变
将转座子随机插入功能基因内，使其失活，也可以用于基因功能研究。

酵母菌双杂交系统
在酵母菌双杂交系统中，将编码这2个功能域的DNA分别构建在2个独立的表达载体上。

在一个表达载体中，与DNA结合功能域的基因片段与待测蛋白质的基因连接成融合
基因。

在另一个载体中，RNA聚合酶激活功能域的基因片段与未知的DNA序列连接成融合蛋白基因。

将这2个表达载体同时转化一个细胞，并在细胞内表达，如果DNA结合功能域蛋白与同RNA聚合酶激活功能域蛋白之间能够互作，就会启动报告基因的表达。

二、请简述植物中同根（orthologous）
基因克隆的原理和方法。

原理：同源基因拥有一个共同的祖先基因，
它们之间有许多相似的序列。

从数据库中查找已知序列的同源基因，根
据已知的同源基因的序列设计引物，设计
引物时可加入一些酶切位点，方便以后的
克隆。

通过PCR法扩增出目的片段，回收
纯化后将其导入T载体转入大肠杆菌，筛
选后就得到该基因的克隆。

orthologs的生
物信息预测方法主要有两类:系统发生方
法和序列比对方法。

这两类方法都是基于
序列的相似性,但又各有特点。

系统发生方
法通过重建系统发生树来预测orthologs,因
此在概念上比较精确,但难于自动化,运算
量也很大。

序列比对方法在概念上比较粗
糙,但简单实用,运算量相对较小,因此得到
了较广泛的应用。

三、在功能基因组学研究中，一项重要
的工作就是构建突变体库，请比较插入突
变（如他T-DNA,AC-DS插入，基因陷阱
等）方法和TILLING（Targeting induced
local lesions in genomes）方法在实验的流
程上的异同，并比较它们在基因功能分析
上的优缺点。

相同点：
不同点：插入突变需要构建载体，需要转基因，而TILLING不需要这些。

插入突变优点：
插入突变缺点：1多拷贝时无法做2易引起染色体重排3方向容易插错4不能移动，需要的转化数多5插入效率低
TILING优点：不需要转基因，高通量、大规模、高灵敏度和自动化
缺点：有时基因有几个拷贝，若只突变一个，因为可能存在互补，所以看不出其变化；有时突变后因为密码子的简并行，也看不出其变化；有时突变后，蛋白质是发生了变化，但可能不影响其功能。

四、通过map-based cloning把目标基
因限定在1个20kb的区段内，请给出鉴定
该区段中是否存在候选基因的方法。

1.筛选与目标基因连锁的分子标记。

利
用目标基因的近等基因系或分离群体分组
分析法（BSA）进行连锁分析，筛选出目
标基因所在局部区域的分子标记。

2.构建并筛选含有大插入片段的基因
组文库。

用与目标基因连锁的分子标记为
探针筛选基因组文库，得到阳性克隆。

3.构建目的基因区域跨叠克隆群
（contig）。

以阳性克隆的末端作为探针基
因组文库，并进行染色体步行，直到获得
具有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠
群。

4.目的基因区域的精细作图。

通过整合
已有的遗传图谱和寻找新的分子标记，提
高目的基因区域遗传图谱和物理图谱的密
谱的密度。

5.目的基因的精细定位和染色体登陆。

利用侧翼分子标记分析和混合样品作图精
确定位目的基因。

接着以目标基因两侧的
分子标记为探针通过染色体登陆获得含目
标基因的阳性克隆。

6.外显子的分离、鉴定。

阳性克隆中可
能含有多个候选基因。

用筛选cDNA文库，
外显子捕捉和cDNA直选法等技术找到这
些候选基因，再进行共分离，时空表达特
点，同源性比较等分析确定目标基因。

当
然，最直接的证明是进行功能互补实验。

五、请简述对一个已经克隆的目的基
因进行功能及信号传导途径研究的思路和
方法。

基因功能的研究可以有如下途径，1.研究基
因的时空表达模式，确定其在细胞学或发
育上的功能，例如，在不同细胞类型，不
同发育阶段，不同环境条件下一级病原菌
侵染过程中mrna，蛋白质表达差异，2，
研究基因在亚细胞内的定位和蛋白质的翻
译后调控等，3利用基因敲除技术进行功能
丧失分析或通过基因的过量表达（转基因）
进行功能获得分析，进而研究目的基因与
表型性状间的关系，4 通过比较研究自发
或诱导突变体与其野生型植株在特定环境
条件下基因表达的差异，另外，有些用于
基因分离的技术。

如mrna差别显示，抑制
性扣除杂交技术等也可用于功能分析。

技
术如northern 印迹，rt-pcr 基因芯片
酵母双杂交基本原理
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调
控中建立 i 。

典型的真核生长转录
因子，如GAL4、GCN4、等都含有二
个不同的结构域: DNA结合结构域
(DNA-binding domain)和转录激活结
构域(transcription-activating
domain)。

前者可识别DNA上的特异
序列，并使转录激活结构域定位于
所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当
部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激
活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋
白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

酵母双杂交系统的建立与发展是基
于对真核生物转录调控起始过程的
认识。

真核生物中存在一种上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)，其作用是和激活蛋白结合并大大增加启动子的转录速度，从而在转录水平对靶基因表达进行调控。

真核细胞转录起始需要反式转录激活因子的参与。

很多真核生物的位点特异性转录激活因子是组件
式的，通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异性结合结构域(DNA-binding domain, BD)与转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。

这两个结构域即使分开时仍各具功能，互不影响。

但一个完整的某个特定基因的转录激活因子必须同时含有这两个结
构域，否则无法完成激活功能。

只有将这两部分通过适当的途径在空间
上接近才能恢复其激活转录的能力。

不同来源的ＢＤ与ＡＤ结合后则特
异地激活ＢＤ结合基因的表达。

基于这一特性，Fields等设计了一个检测蛋白质与蛋白质相互作用的系统。

选择的转录激活因子是酵母细胞中的GAL4蛋白。

分离GAL4蛋白N端的
1-147个氨基酸（BD）和C端的
768-881个氨基酸（AD），分别构建重组质粒。

如果在BD上接上一个蛋白X，在AD上接一个蛋白Y，再将这二个质粒共同导入酵母菌中，若X，Y 蛋白在酵母内发生交互作用，则相当于将GAL4的BD和AD又连在一起，即可以转录激活下游报告基因的表达，通过测定报告基因的产物及活性来检测这种交互作用的发生。

理论上，任何能在酵母中表达的基因均可作为报告基因，较为常用的是LacZ，和一些营养缺陷标记，这种报告基因只允许阳性克隆生长，最常用的是HIS3和LEU2。

近来为了更灵敏、特异地筛选阳性克隆,常同时使用两种或两种以上的报告基因(如ADE2和URA3)，一则它可以允许用比单纯颜色筛选更大的菌落密度铺板，从而获得较丰富的表达产物，二则双重筛选相互验证，可以排除一些假阳性结果；三则转化体制造了大量的融合蛋白以保证基因产物满足生长需要，结果LacZ转录提高，从而β-半乳糖苷酶的活性亦增强。