新鲜马齿苋中黄酮的提取及其凝胶剂的制备

近些年来,随着人类健康意识增强，很多人关心食品卫生问题,特别是微生物滋生的危害。长期食用某些变质食品, 可导致原癌基因被激活[1]。然而天然防腐剂能抑制原癌基因被激活,抑癌基因更加稳定。因此,从自然界的野生植物中分离出能够抑制细菌生长的物质可以降低发生率,并开发为食品防腐剂，意义深远。经研究表明马齿菜中有许多黄酮类化合物，能够使菌体的细胞膜破裂导致植物的有丝分裂停止从而使细胞增殖停止,,而且这种作用很稳定,增长保鲜时间[2]。因此，研究新鲜马齿苋中黄酮的最优提取方法为抑菌作用的研究奠定了坚实的基础，具有重要的意义[3]。
1.1 马齿苋的概述
1.1.1植物形态和来源
马力苋叶宽叶大而多肉，窄叶苋植株小而干枯；欣赏苋花小、灿烂[3]。几乎分布在我国除寒冷地区外的其他地方。能适应各种环境，比如： 干旱、洪涝、寒冷、高温、阴暗，也不容易被虫子袭击。种子可随雨水发芽成长[4]。
1.1.2化学成分
完整的马齿苋中的化学成分百般。含有异黄酮类化合物，首要有料梁木素-7-O-葡萄糖和料梁木素；含有香豆素类，首要有佛手柑内酯、东莨菪亭；含有大量不饱和脂肪酸，主要有亚油酸、山acid酸；含有大量无机盐，首要有钙盐、钾盐。除此马齿菜整株中还含有生物碱类、氨基酸等一点儿活性物质。鲜马齿苋中含有富饶的L-去甲基肾上腺素、多巴胺和少量的多巴来促进兴奋的物质，还含有一种特殊的甜菜黄素，其具有荧光酶活性。
1.1.3药理作用
马苋拥有抑制抑菌生长繁殖的作用，马齿觅中拥有富饶的还原性成分，例如胡萝卜素能够促进新陈代谢；抗血拴形成，进而很好地调节和保护心血管系统[5] 。
1.1.4临床作用和开发利用
临床上常用以马齿苋提取物为主药制得的药物治疗肺部感染、皮肤腐烂、急性阑尾炎、蛇虫咬伤。还能治疗缺乏胰岛素导致的糖尿病和胰腺被破坏的糖尿病[6]。在开发利用方面,马齿苋主要涉及药品、保健食品、化妆品、护发品日用品及动物饲料等,是极具开发前景的中药材[4]。吴晓等通过对马齿苋酸奶的研究，研制出含量均匀度良好，不浮现分层现象，没有气泡发生，不仅具有酸奶特有的味道，还具有新鲜马齿苋散发出的香草味[7]。
1.2 黄酮提取工艺
1.2.1 浸渍提取
陈孜铜等酿制葡萄酒，是采用四种浸渍方法，这四种方法分别为正常浸渍法、高温浸渍法、低温浸渍法、后浸渍法。从葡萄酒中一些内在物质的含量和外观性状来判断最佳提取工艺。比如测定葡萄酒中酒精、总酚、总酸的含量，观察制得的葡萄酒外观颜色及颜色深度。实验结果说明，这四种浸渍方法中后浸渍法是最优酿制工艺[8]

。
梁学军结合自身的生产实践经验，以理论知识为依据，得出二氧化碳浸渍法酿造的葡萄酒有着不同的特点这一结论。二氧化碳浸渍法是将没有腐烂的新鲜葡萄放入充满二氧化碳的且与空气隔绝的密封瓶中若干天的一种酿酒工艺，二氧化碳的来源包括外界提供的，裂开的葡萄无氧呼吸产生的，可能是两种途径都有。二氧化碳浸泡法酿造的葡萄酒是经过多种调节酶的相互作用，具效率高产量多的优点。然而二氧化碳浸渍法酿造的葡萄酒也有不足的地方，比如不易选择合适的葡萄种类；对葡萄的生长环境要求严格；不宜长期贮存；采收新鲜葡萄时耗费大量劳动力增加了成本，实验经验说明在实践中只有充分了解了酿酒技术的优点和缺点，充分利用好优点同时尽可能改善缺点才能在生产过程中以最大程度发掘葡萄的优良品质[9]。
1.2.2榨汁提取
杨治富等人将红旱菜作为原料，对它的不同部位都采取榨汁的方法来提取红色素。主要步骤是分别取等量洗净的红旱菜的叶、茎、根，捣碎再用榨汁机榨汁[9]。王永根等人取适量且洗净的苹果片，利用研磨过滤器和榨汁机这两种机器榨取苹果汁，研究苹果汁中的果胶酶受到的影响，比较分析实验结果可知通过研磨过滤的方法对果胶酶的影响较小[10]。石杏琴将柑桔全果进行榨汁，分别取等量的榨汁液放入洗净的离心管中。然后对称放入离心机中来离心分离除去榨汁液中的果浆[11]。
1.2.3煎煮提取
安玉秀等人通过正交实验来选取赤芍的最佳提取工艺以及它的提取工艺参数。以赤芍中的芍药苷含量为判断标准, 利用控制变量的办法来提高提取效果。实验证明用十倍量的水提取四次，每次两小时这一条件下的芍药苷提取效率最高，化学性质稳定，所以该方法宜工业生产[12]。
刘险峰取等量银翘散汤剂，对比探索不同的煎煮方法得到的煎煮液对抗炎解热作用的效果，他挑选八名发热患者随机分为四组，都为煎煮但方法不同，分别为传统条件、高压环境和常压，空白对照实验，经过议定对四组发热患者与正常体温类比，表示服用用传统方法制得的银翘散汤剂组患者体温下降不同，差异明显[13]。
陈金月等人制备驻车方汤剂，经过议定类比采用微波和传统的方法提取效率，结果发现微波和传统条件下煎煮效果不相上下, 但传统煎煮法比微波煎煮法消耗的时间和能量更少，他们得出结论：传统煎煮法可以被微波煎煮法替代[14]。
1.2.4其他工艺提取
张特立等人通过超声提取法和回流提取法来提取马齿苋中的黄酮，分析哪种方法分离的总黄酮含量较高,实验结论:回流提取法较好，可落实 ,能用于马齿苋总黄酮的提取[6]。 翟

硕莉以超临界CO2为萃取剂来提取分离马齿苋中总黄酮，利用控制变量法,从分离的气压、湿度、先后顺序、用量4个因素考虑，针对超临界CO2萃取技术分离马齿苋中总黄酮开展了研究并探索最佳萃取工艺条件讨论[7]。
1.3黄酮含量测定
1.3.1紫外分光光度法
紫外分光光度法为分子吸收光谱，采用紫外可见吸收光谱，判断官能团，对物质的性质分析、含量分析，紫外可见光区波长的单位通常用nm表示，包括可分为远紫外区，近紫外区和可见光区[15]。
梁璇采用紫外分光光度法测定百合知母汤中的黄酮的含量，得到结果： 黄酮的最大吸收波长为256nm，由线性回归方程可知稳定性良好，重现性良好[16]。
1.3.2高效液相色谱法
高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，包括正相色谱和反相色谱。正相色谱采用的流动相为苯-乙睛或者苯-丙酮液体，常用于分离无羟基、甲基化或乙酞化的黄酮类化合物。反相色谱常用的洗脱剂为甲醇-水-乙酸或磷酸缓冲液或者乙睛-水，常用于百般黄酮类化合物的分离。特点：高压，高效，高灵敏度，分析速度快，用时少，选择性高，普遍应用[17]。
1.3.3薄层层析法
将已知量的溶解度不用的混合溶液放于薄层板一头固定位置，在不与外界互通的的容器中用适当的展开剂展开，通过物理或者物理化学的方法观察组分斑点的移动距离，根据比移值和相对比移值及斑点大小进行定性定量分析的方法称为薄层色谱法。常用的吸附剂有常作干燥剂的硅胶和三氧化二铝。它的特点是少量速度快，用于特定物质的甄别和混合物的分开自己含量的测定，根据分离原理不同，薄层层析可以分为吸附薄层层析和分配薄层层析[18]。
邓双等人为了测定了黄芩中具有生理活性的物质即黄芩苷的含量，采用薄层色谱新型内标法；沈宁将基于数字图像原理的薄层扫描色谱技术应用于南五味子中五味子甲素含量测定,证明该分析方法经济可靠[18]。
1.4中药凝胶剂
1.4.1中药凝胶剂定义
中药凝胶剂是指药物与适宜的辅料混合，通过研磨发出“噼啪声”，制成凝胶状的半固体的一类药物。中药凝胶剂是以中药提取物为主药，将它与凝胶混合在一起，经过外部给药的方式，经过透皮吸收达到为患者进行治疗的目的。有能力经过嘴巴、黏膜等多种途径给药[19]。
1.4.2中药凝胶剂的研究现状
周彤研究了复方紫草凝胶剂的制备，采用控制变量的办法来精选中药材紫草的分离效果最好的办法,利用高效液相色谱法对含量采取测定,创建了左旋紫草素的含量测定方法。她的实验中还提及到其他三种药材，这三种药材分别为黄柏、当归、苦参。对他们的指定成分进行含量提取、

区别和含量测定。实验结果表明,这几种药材的特定成分在指定的范围内呈现良好的比例关系,他们相对标准偏差良好，加样回收率等均符合要求,能够用于中药成分的含量分析和特定要求[19]。
傅炜研究了复方中药凝胶的制备方法，她的实验首要研究了优化中药复方凝胶剂的制备工艺和中药复方凝胶剂是将药材提取物和水煎液为主要原料的中药外用制剂,通过控制变量的方法研究了工艺提取，表明本制备工艺稳定、可靠[20]。
1.4.3新型中药凝胶剂的应用
如今中药经皮给药引入了一些新型凝胶，比如脂质体凝胶、包合物凝胶、微乳凝胶。这些技术的引进不仅提高了药物的理化性质的稳定、增加了药物的缓控释能力和靶向定位能力， 而且具有更有利于被皮肤吸收，促进了中药经皮凝胶剂对的广泛利用。现如今中药凝胶剂应用于皮肤病、骨伤科等。一些人对中药凝胶剂的研究也促进了它的发展[21]。
1.4.4马齿苋凝胶剂的制备
选择明净无腐败的马齿苋嫩茎几许，减去根部，除掉叶花种子等其余杂质，反复洗净后沥干水分，由于马齿苋中含有较多的多糖，粘性较大，所以在沸水中热烫2-3分钟来降低粘性，捞出沥干冷却备用。以不同提取方法得到的提取液经过浓缩，然后以浓缩液为基质采用研磨法制备凝胶剂[22]。
2 新鲜马齿苋中黄酮的提取及其凝胶剂的制备
2.1 实验材料
2.1.1 药品与试剂
新鲜马齿苋若干（购自潮潮农家店，产自广东揭阳，由药学院施伶俐副教授鉴定为马齿苋）、芦丁标准品（购自安徽合肥BOMEI实验商场，批号：201901012x）、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、卡波姆 、三乙醇胺 、聚山梨醇、果胶酶 、薄荷香精 、乙醇、 苯甲酸钠，均为分析纯，水为蒸馏水。
2.1.2 仪器
KDM型可调控温加热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；
AB120-S电子天平（瑞士梅特勒集团）；
TU1810紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；
烧杯、玻璃棒、容量瓶、移液器、塑料滴管、纱布等。
2.2线性关系考察[22]
用拥有明确刻度的分析天平称量芦丁对照品试剂20mg,用50％的乙醇溶解，移液到50mL的容量瓶中，继续加乙醇至凹液面的最低处，上下震荡摇匀，得到0.4mg/mL的标准溶液。
用适宜刻度的移液管汲取该芦丁标准溶液，分别放在10mL的容量瓶中，汲取的标准品体积分别为0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、，加适量的水，然后加入5％亚硝酸钠0.4mL，混合均匀搁置五分钟，继续放10％硝酸铝0.4mL，三百六十度旋转然后放置五分钟，再加4.3％氢氧化钠4mL，再加水到刻度线，上下抖动15分钟，以空白试剂作为参比溶液，用紫外分光光度法在500nm下测量吸光度

，得到浓度和吸光度的标准曲线：
2.3马齿苋中总黄酮含量的提取研究
2.3.1提取方法
榨汁：将准备好的马齿苋500g切碎，放在研钵中捣碎然后置于纱布中榨汁。
浸渍：将准备好的马齿苋500g切碎，置于烧杯中，加入适量的蒸馏水，淹没马齿苋即可。开始计时，每隔24小时、12小时、6小时换一次蒸馏水。
煎煮：将准备好的马齿苋500g切碎，置于烧杯中，加入适量的蒸馏水，放在加热套上加热，然后放在水浴锅中水浴加热。
2.3.2总黄酮提取液的浓缩
将上述浸渍和煎煮得到的提取液各取等量即50mL置于烧杯中，然后置于加热套上加热浓缩至一定粘稠状。
2.3.3提取物总黄酮含量测定
用拥有精密刻度的分析天平称量马齿苋浓缩液20mg,用50％的乙醇溶解，移液到50mL的容量瓶中，继续加乙醇至凹液面的最低处，上下震荡摇匀，得到0.4mg/mL的供试品溶液。
用适宜刻度的移液管汲取该供试品溶液，分别放在10mL的容量瓶中，汲取的标准品体积分别为0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL、，加适量的水，然后加入5％亚硝酸钠0.4mL，混合均匀搁置五分钟，继续放10％硝酸铝0.4mL，三百六十度震荡放置五分钟，再加4.3％氢氧化钠4mL，再加水到刻度线，振荡摇匀15分钟，以空白试剂作为参比溶液，用紫外分光光度法在500nm下测量吸光度，根据标准品的线性回归方程代入得到马齿苋中黄酮含量：
凝胶剂的制备研究
2.4.1凝胶剂的制备
处方：卡波姆940 10g 甘油50g 聚山梨酯80 2g 氢氧化钠4g 25％乙醇50g 羟苯乙酯0.5g 蒸馏水加至1000g
制备：调用卡波姆940、甘油、聚山梨酯80与300mL蒸馏水混合，取马齿苋煎煮液的浓缩液10mL，将氢氧化钠溶于100mL蒸馏水中后加入上述液体搅拌，再将羟苯乙酯溶于乙醇后逐渐加入搅匀，即得透明凝胶。
处方中，卡波姆为水溶性基质；聚山梨酯80能增加卡波姆的亲水性；氢氧化钠为pH调节剂，使形成凝胶；甘油为保湿剂；羟苯乙酯为防腐剂；25％的乙醇具有防腐和潜溶的作用。
2.4.2马齿苋凝胶剂皮肤刺激试验
进行皮肤刺激试验，考察马齿苋凝胶剂的安全性。对三个年龄段的人群分别进行皮肤刺激实验。具体操作如下：随记试验20-30岁、30-40岁、40-50岁的健康且都无马齿苋过敏原的人群，这三个年龄段各四个人，对他们在相同环境下进行涂抹等量的空白凝胶剂和马齿苋凝胶剂，结果表明空白凝胶及马齿苋凝胶剂受试区皮肤均无红斑和水肿现象，无刺激。结果表明马齿苋凝胶剂具有良好的透皮吸收功能，其安全性较好[21]。
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3 结论与讨论
3.1 结论
芦丁线性关系良好，表明在此范围内，实验所测定的响应值和其浓度呈线性比例关系。在对等量的新鲜马齿苋进行黄酮的

提取实验，采取三种不同的方法，分别为：榨汁、浸渍、煎煮。结果表明马齿苋煎煮液的浓缩液制成的供试品中黄酮的含量最高。将马齿苋煎煮液的浓缩液作为基质制成凝胶剂 ，对该马齿苋凝胶剂进行皮肤刺激性实验，结果表明具有良好的透皮吸收效果，安全性较高。
3.2 讨论
将芦丁作为对照品，由于前期有人做过所以没有进行方法学考察。（原因写详细点，可查一些文献），本实验对新鲜马齿苋中总黄酮的提取采取榨汁、浸渍、煎煮，这些提取方法简单环保；测定新鲜马齿苋中总黄酮含量采用的是紫外分光光谱法，因为紫外分光光度法测定速度快，在5分钟之内即完成，准确度较高，应用范围较广；马齿苋凝胶剂的制备采用研磨法，操作简单可行。