马齿苋黄酮有效部位改善胰岛素抵抗的作用机理研究

华中科技大学

博士学位论文

马齿苋黄酮有效部位改善胰岛素抵抗的作用机理研究

姓名：雷红伟

申请学位级别：博士

专业：中西结合基础

指导教师：陆付耳

2010-05

华中科技大学博士学位论文

中文摘要

第一部分

马齿苋总黄酮的提取和其含量及相关成分染料木苷含量的测定

【目的】：

在前期研究的基础上,本实验主要提取和制备马齿苋黄酮有效部位，同时利用高效液相鉴定马齿苋黄酮的相关成分，用RP-HPLC对相关成分的含量进行测定。

【方法】：

每公斤马齿苋全草用含3%（g/ml）氢氧化钠和60%（ml/ml）乙醇碱性醇液煎煮三次，时间分别为2 h 、1h、0.5h，收集三次提取液，蒸发其中的乙醇至无醇味。

将浓缩提取液上1m×10cm的聚酰胺柱，柱高40cm，吸咐2h,倒掉滤液，再用双蒸水反复洗脱至洗脱液无色为止，弃此洗脱液；最后用95%（ml/ml）乙醇洗脱，至洗脱液为淡黄色时停止，收集此洗脱液，进一步用旋转蒸发仪蒸发得含生药6 kg.L-1的马齿苋黄酮提取液。

利用黄酮与亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠形成络合物，用分光光度计在510nm可见光处测定其吸收度，进行总黄酮含量的测定。用RP-HPLC鉴定马齿苋黄酮的相关成分并进行含量测定。

【结果】：

马齿苋总黄酮的含量占其全草总重量的7.67%，该产品可用于制备胰岛素增敏剂。马齿苋黄酮部位中染料木苷与标准品中染料木苷保留时间一致，染料木苷在 6.25 µg.L-1～200.00 µg.L-1线性关系良好，r=0.9999。含生药6 kg.L-1的马齿苋黄酮提取液中染料木苷含量为1.68mg.L-1。

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【结论】：

马齿苋全草中含7.67%黄酮，染料木苷为本总黄酮的相关成分，含生药6 kg.L-1的马齿苋黄酮提取液中染料木苷含量为1.68mg.L-1。

【关键词】：

马齿苋黄酮分光光度法HPLC染料木苷

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第二部分

染料木苷改善HepG2细胞中FFAs诱导的胰岛素抵抗

【目的】：

在前期实验的基础上，本实验采用软脂酸诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗，同时观察染料木苷对HepG2胰岛素抵抗细胞培养基中葡萄糖消耗的影响以及染料木苷影响葡萄糖消耗的初步机理。

【方法】：

体外培养HepG2细胞，用0.5mmol/L软脂酸诱导HepG2细胞造胰岛素抵抗模型，同时使用不同浓度的染料木苷(1、2、4µmol/L)以及作为阳性对照的罗格列酮(1µmol/L)干预24 h，用MTT法检测药物对细胞增殖能力的影响，用葡萄糖氧化酶法测定培养基中葡萄糖的含量，用免疫印迹的方法测定葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达水平。

【结果】：

与正常对照组比较，1-4µmol/L的染料木苷对HepG2细胞增殖的影响无明显差异(P>0.05)，葡萄糖消耗量随着染料木苷的浓度增加而明显提高，各组与模型组比较差异明显(P<0.05 or P<0.01)，葡萄糖消耗量最大增多0.35mM；治疗各组中HepG2细胞GLUT1蛋白表达水平与模型组比较明显增强。

【结论】：

染料木苷能改善软脂酸诱导HepG2细胞的胰岛素抵抗，作用随剂量增加而增强。

【关键词】

染料木苷；软脂酸；HepG2；胰岛素抵抗；GLUT-1

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第三部分

染料木素通过抑制JNK信号转导通路改善HepG2细胞中

胰岛素抵抗的实验研究

【目的】：

本实验重点研究染料木素对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用。通过观察各组HepG2细胞培养基中葡萄糖含量在用药前后的变化，测定J NK信号通路各级信号转导蛋白的表达情况，对染料木素逆转胰岛素抵抗的作用和分子机理做进一步的研究。

【方法】：

模型组用含0.5 mmol/L PA/0.2% BSA无血清的高糖（22.2mmol/L）DMEM培养HepG2细胞，建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型；正常组用含或不含1nmol/L胰岛素、0.2% BSA无血清的高糖（22.2mmol/L）DMEM培养HepG2细胞；模型组用含或不含1nmol/L胰岛素造模液造模；阳性对照组用含或不含1nmol/L胰岛素造模液培养，同时加入1µmol/L罗格列酮干预；不同剂量染料木素组用含或不含1nmol/L胰岛素造模液培养，分别同时加入1µmol/L、2µmol/L、4µmol/L染料木素。干预24小时后，取出各组培养液用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖含量。用MTT法检测药物对细胞增殖能力的影响，用免疫印迹的方法测定JNK信号转导通路中T-JNK、P-JNK、IRS-1、IRS-1Ser307、PI-3K p85、GLUT1的蛋白的表达。

【结果】：

与正常组比较，含胰岛素的模型组葡萄糖消耗明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，含胰岛素的罗格列酮组和不同剂量染料木素组葡萄糖消耗明显增加（P＜0.05 or 0.01），无胰岛素各组葡萄糖消耗无明显区别。免疫印迹结果表明，与正常组比较，模型组中T-JNK、P-JNK、IRS-1Ser307蛋白表达显著增加，IRS-1、PI-3K p85、GLUT1表达明显减少；与模型组比较罗格列酮组和不同剂量染料木素组中T-JNK、P-JNK、IRS-1Ser307蛋白表达显著减少，IRS-1、PI-3K p85、GLUT1表达明显增加。

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【结论】：

染料木素与罗格列酮相似能改善HepG2细胞中软脂酸诱导产生的胰岛素抵抗，具有胰岛素依赖性。染料木素逆转HepG2细胞胰岛素抵抗的机制可能与改善JNK信号转导通路中信号分子的表达有关。

【关键词】：

染料木素胰岛素抵抗JNK游离脂肪酸HepG2