现代医学实验学_成骨细胞的培养和骨折模型的制作

注意问题
1.成骨细胞的取材： 新生SD大鼠的乳鼠 新生24h-72h的乳鼠 2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太 多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（ 越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消 化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入 2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原 离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加 适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离 心管的底壁。
小鼠原代培养
1.取新生3d以内BALB/c小鼠，断颈处死后立即投入75%酒精 中消毒5min。 2.D-Hank’s液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织， DMEM清洗颅骨骨片并剪碎 3.加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37°恒温消化20min， 吸出消化液，之后1mg/1mlI型胶原酶37°恒温消化20min后离 心（1000r/min，5min），弃上清液 4.加入含15%血清的DMEN培养基，吹打骨片（力气不要过大， 但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将 细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃ CO2恒温孵育箱中培养。
成骨细胞的鉴定
形态学观察 碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase，ALP) 钙化结节染色
细胞株
MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞）， MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠颅顶前骨细 胞亚克隆14）
MC3T3- E1 细胞
体外培养成骨细胞的影响因素
物理因素
1 电离辐射 单次低剂量辐射（40 cGy 以下）对大鼠成骨细胞 样细胞不会引起明显的改变 ,而单次高剂量辐射（ 400 cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的 ALP 活性增加. 2 微重力 目前认为失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质 脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性
4 转化生长因子-β（TGF-β）
骨是TGF-β最大的组织来源和储存库，成骨 细胞是骨组织中合成TGF-β的主要细胞。同 时，在成骨细胞的细胞膜上有TGF-β的特异 性受体，TGF-β可作用于成骨细胞，调节其 增殖和分化。体外研究表明，TGF-β对成骨 细胞的作用是非常复杂的。
激素
1 生长激素（GH） GH 对骨有促生长作用 人类生长激素能够增加人类骨髓基 质细胞的胶原产物 2 雌激素（E） 绝经后雌激素水平下降造成骨质疏松，提示了雌激素对成 骨细胞的重要性。有研究发现，雌二醇（E2）可浓度依赖 性的刺激人的类成骨细胞株TE85 细胞增殖促进细胞胶原 蛋白及碱性磷酸酶和骨钙素的合成。 3 甲状腺激素 T3 可刺激骨钙素和胶原的产生，还可通过成骨细胞增加 生长因子和结合蛋白的合成和分泌
家兔骨折模型的复制
将实验动物用戊巴比妥钠 耳缘静脉麻醉， 在无菌操作下, 取右挠骨中段背侧纵行切 2cm, 在肱挠肌键深面纵行切开骨膜约6cm,、 环形剥离骨膜,,用特制宽度为3mm 单叶手 锯, 将挠骨垂直锯断造成3mm缺损(分离移 位, 对侧骨膜完整)冲洗缝合骨膜皮肤.
大鼠骨缺损模型的建立：
2 犬模型
犬是制备骨折愈合模型最常用的动物 。 成 年犬与人类骨骼相似程度最高，并且根据 检测，犬的骨折强度也与人类相似 。 另一方面，犬是杂食类动物，其消化系统 与人相似，可进行口服给药。
3 兔模型
兔性情温顺，便于饲养，耳缘静脉便于取血，也是制备模 型时较为常用的动物。兔的骨骼转化速度快，约达到了人 类的 3 倍， 因此可以在短期内观察骨折愈合时骨组织的 变化 但兔是草食类动物，消化系统与人差异较大，不应用于骨 折愈合的药物治疗实验。 兔的后肢发达，股骨粗大，可 用于股骨头坏死的动物模型制备，也多用于疲劳性骨折的 模型制备
分别将家兔四肢固定,以50kg的重物压迫家 兔的左右肢,持续1小时,1小时后解除压迫和 固定,家兔左右后肢出现强直,失去运动能力， 活动以健肢代替，除去后肢骨折和脱臼的 家兔，即为实验用左后肢软组织损伤病理 模型。
6.离心
Leabharlann Baidu
大鼠成骨细胞的培养
将SD 乳鼠置入75 %酒精中浸泡5min。于超净 台 上取顶骨,放入PBS 皿中,刮除附着组织,待骨质发 白、透亮,再放入PBS 小瓶反复冲洗,换液3 次,以 0.1 %II型胶原酶消化30min 后吸弃酶液,再以PBS 冲洗3 次 ，加入0. 1 % II型胶原酶,将骨剪成 1mm2 大小,放置15min 后加入与酶液等量的含15 %小牛血清的DMEM 培养基,吸取上清液,以1 000r/ min 离心10min ,将下层液接种于50ml 培养瓶,离 心液去上清后接种于25ml 培养瓶,分别加入上述 培养基,置入37 ℃、5 %CO2 、饱和湿度培养箱内。 每2 日换液1 次,待细胞长满后,用0. 25 %胰蛋白 酶消化,按1∶2 比例传代。
成骨细胞的培养及骨折模型的制作
青岛大学医学院 阎春玲
成骨细胞的培养及检测
成骨细胞的培养可广泛应用于骨折及骨损 伤的疾病研究中，同时为筛选新型药物和 研究机制提供离体研究。 原代培养 细胞株
原代培养
成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨 为成骨细胞的常用来源。 有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明 所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学 活性及发生钙化的功能。 有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现 ，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸 酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可 以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。
2铝
目前认为一些疾病如骨质疏松、骨软化等 与铝中毒有关。铝蓄积于骨骼，对骨骼和 神经系统等产生危害。文献报道低浓度铝 可刺激体外培养的成骨细胞的增殖和分化 ，铝对成骨细胞的作用不受培养液中生长 因子变化的影响。高剂量铝可抑制成骨细 胞的生长发育并对其产生一定的毒性作用
3氟
氟 一方面 作为骨基质构成物参与骨形成过程 ，另一方面，过量的氟摄入可导致齿、骨等 组织及器官的损害。体外研究则表明，氟通 过对成骨细胞的有丝分裂的作用促使成骨细 胞的生长速度加快、数量增多、功能增强。 氟对成骨细胞的作用与铝有所不同，需依赖 于培养液中部分生长因子，除去这些生长因 子，可消除氟对成骨细胞的作用.
的降低。
3 外力 Hasegawa 等将鼠成骨细胞培养在可变形 塑料膜上，使膜均匀变形，发现机械拉伸 能刺激成骨细胞增加DNA 合成， 适当的拉 应变 刺激，可使培养的细胞中DNA 含量明 显增加，还可导致成骨细胞的增殖变快。
微量元素
微量元素在骨的形成和生长分化过程中起 着重要作用，微量元素缺乏可能使骨骼发 育受到碍，甚至可能发生畸形，成骨细胞 增殖分化的过程与某些微量元素有着密切 的关系
选用健康体重为250±20gWistar大鼠 ，用3%戊 巴比妥钠30mg/Kg腹腔注射全麻，在无菌操作下， 用12号针头经皮钻孔消弱右侧胫骨皮质。经前正 中做皮肤切口至近端胫骨结节，用9号针头经相应 的皮质插入髓腔，终于远端胫骨生长板的近端。 在预先消弱点做胫骨骨折。术后用1号线缝合皮肤， 摄X线片证明固定和复位。麻醉清醒后，自由活 动
骨质疏松模型的建立
雌性SD大鼠 体重220～260 g，分为对照组、 假手术组、去势组。除对照组外，其他各 组大鼠行卵巢切除术，以l％戊巴比妥钠3～ 4 ml／kg腹腔注射麻醉，无菌条件下行背部 肋下双侧卵巢切除，假手术组术式相同， 但不摘除卵巢。术后常规饲养、自由饮水 摄食
挤压挫伤模型的建立
骨折模型的建立
1 鼠模型 鼠价格低廉、喂养方便、生长周期短，并且基因组图谱详 尽，可以更好地研究骨修复分子机制，是常用的骨折愈合 动物模型。鼠的骺板终生存在，可用于制作婴幼儿骨骺坏 死的模型。并且鼠没有呕吐反射，在进行口服给药并且需 要定量的实验中较为适用。 在大鼠胫骨 和股骨 上制备横形骨折模型。这种模型可重 复性高、操作简便。
其它
铜对骨骼的形成和维持很重要。缺铜骨质 中胶原纤维合成受损，骨骼发育受限，结 构疏松，长骨易碎，骨发育停止。 锰对粘多糖、溶胶原的合成和骨形成有特 殊作用。 故补充锰对粘多糖的合成有利 镁、钙等对体外培养SD大鼠颅盖骨成骨细 胞样细胞的增殖分化都具有一个最佳峰值.
生长因子
1 骨形态发生蛋白（BMP） 1982 年，Urist 等人从牛骨中提纯了牛的 BMP, 并提出了诱导成骨的新概念。BMP 是一种多肽，具有高效的骨诱导能力，能 够促进未分化的间充质细胞和成骨细胞的 前体细胞分化为成骨细胞；引导成骨细胞 表型的表达等。体外实验中，将BMP 与载 体结合临床治疗骨缺损已有许多成功例证.
1锌
锌是人体所必需的微量元素，它参与了机 体新陈代谢的各个方面。近年来的研究证 实锌与骨代谢及机能的关系非常密切，锌 缺乏会影响骨骼的生长发育，促进骨质疏 松的发生与发展。体外实验表明，锌能够 促进大鼠成骨细胞的增殖及分化，促进 MC3T3-E1 成骨细胞蛋白质及DNA 的合成 。而锌缺乏则抑制大鼠成骨细胞的增殖分 化；锌浓度过高会对细胞产生毒性.
传代培养步骤
1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心） 2.用PBS冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来） 3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆， 间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。 4.加入含15%的牛血清培养液终止消化 5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或DHANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净
2 血小板衍生生长因子（PDGF） PDGF 是一种存在于多种组织中的促细胞 有丝分裂的多肽生长因子，能刺激多种细 胞分裂、增殖。有研究表明，PDGF促进鸡 胚颅骨和新生小鼠颅骨来源的骨细胞的增 殖，并使胶原蛋白合成增加。
3 成纤维细胞生长因子（FGF）
骨组织内FGF 主要贮存在胞外基质中 是成 骨样细胞和骨细胞的强促分裂因子。研究 显示，FGF 能刺激成骨细胞内的DNA 合成 ，使成骨细胞内骨钙素增加，加速骨的钙 化，使新骨形成。
3.培养基问题：低糖的DMEM培养基
4.培养瓶 培养瓶在接种前，使用1%多聚赖氨酸快速包被（具体方 法：每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体 ，拧上盖子，放置30min，倒掉1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBS 液冲洗两遍）， 包被的培养瓶，细胞很容易贴壁 。
大鼠成骨细胞