黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的酶学性质研究

文章编号:1000-1573(2006)04-0069-05

黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的酶学性质研究

王志新, 于宏伟, 韩 军, 李 宁, 林 杨, 贾英民

y

(河北农业大学食品科技学院,河北保定071000)

摘要:为研究葡萄糖氧化酶的酶学性质,对黑曲霉A9发酵液提取纯化,酶蛋白达到电泳纯,然后对纯酶进行酶学性质研究。结果表明:葡萄糖氧化酶的分子量为138200Da,糖基化程度为2 67%,最适pH 为6 7,最适温度为30 ,该酶的pH 稳定范围较宽,而且热稳定性很好,Ag +、Hg 2+、亚硫酸氢钠对酶有强烈的抑制作用,该酶对葡萄糖的Km 值为35 74mmo l L 。该研究表明,黑曲霉葡萄糖氧化酶具有潜在的应用价值,最适合应用于食品、医药及生物等领域。

关 键 词:葡萄糖氧化酶;黑曲霉;性质

中图分类号:Q 93-3 文献标识码:A

Studies on the properties of glucose oxidase

from Aspergillus niger A 9

WAN G Zhi xin ,YU H ong wei ,H AN Jun ,LI N in g ,LIN Yang ,JIA Ying min

(Department of Food Science and T echnolog y,A gricultural U niversity of Hebei,Baoding 071000,China)

Abstract :In order to study the properies of g lucose ox idase,we purified glucose oxidase from As p ergillus niger A9fermenting liquor to obtain a single com ponent,then studied the properies of the purified glucose oxidase in this experiment.It is show n that the molecular w eight,the optimal pH,and temperature is 138200Dalton,6 7and 30 respectively,the pH stability is w ide and the thermal stability is very good,the glucose ox idase w as inhibited strongly by Ag +

、H g 2+

、NaHSO 3and the Km of g lucose w as 35 74mmol L.This research indicated that glucose oxidase had poten tial applied value and fitted to apply in the fields of food,medicine and biolog y etc.Key words :glucose oxidase;A sp ergillus niger ;properties 葡萄糖氧化酶(Glucose Ox idase,简称GOD)系统名为 -D-葡萄糖:氧化还原酶(EC1.1.3.4)。它能专一地将 -D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过

氧化氢[1]

。

葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。在食品工业中,用于去除食品中的葡萄糖,防止褐变及海鲜变质;还可用于食品脱氧,改善食品和饮料的品质;同时还用于面粉的改良工艺

等方面

[2]

。在医药工业中,用于血糖的测定及尿糖、

尿酮体的检测,可制成糖尿试纸或试剂盒用于临床

诊断;还可防止口腔疾病和牙病的发生[3]

。在生物方面,可制成传感器,用于发酵过程中葡萄糖浓度的在线检测,是生物传感器领域最主要的工具酶。另外葡萄糖氧化酶的发酵产物葡萄糖酸还可用于生产葡萄糖酸钙、酸锌口服液等。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物

y

收稿日期:2006-03-02

基金项目:河北省十五农副产品加工重大专项课题 酶工程技术在农产品深加工中应用研究(03220173D) 资助作者简介:王志新(1980-),女,河北辛集人,硕士,主要从事向酶工程研究.

通讯作者:贾英民,男,教授,从事食品微生物研究.E mail:ymjia@https://www.360docs.net/doc/e416329771.html,

第29卷第4期2006年7月

河北农业大学学报

JOURNAL OF AGRICULT URAL UNIVERSIT Y OF H EBE I

Vol.29No.4Jul .2006

株[。为了进行葡萄糖氧化酶酶学性质、催化机理、蛋白质序列及基因等方面的研究,首先要对其进行提纯,因为黑曲霉或青霉在产生葡萄糖氧化酶的同时还常伴有过氧化氢酶、 -淀粉酶、蔗糖酶和其他杂蛋白的产生[4,5]。

本试验从实验室所筛选到的一株黑曲霉菌株A9出发,进行葡萄糖氧化酶的发酵生产,然后通过提取纯化得到单一组分,着重对纯化所得的单一酶蛋白进行酶学性质的研究,为其应用提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 河北农业大学食品科技学院酶工程实验室筛选并保存的黑曲霉菌株A9。

1.1.2 主要药品 葡萄糖(上海生化试剂厂),辣根过氧化物酶(北京夏斯进口分装),4-氨基安替吡啉(天津华东试剂厂),苯酚(北京化学试剂二厂),牛血清蛋白(上海长阳试剂厂),Sephadex G-100,Seph adex G-25(w hatan),DEAE-cellulose32(Pharm a cia),PEG-20000(日本进口分装),考马斯亮蓝G -250(Fluka),其它试剂均为分析纯和化学纯。

1.1.3 主要仪器 BIOF-2010型玻璃发酵罐(上海理工大学高机实业总公司),GL-20G- 高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂),M illipore超滤系统(日本密里博公司国际部),TH-梯度混合仪(上海青浦沪西仪器厂),BSZ-100部分收集器(上海青浦沪西仪器厂),FD-1冷冻干燥机(北京博医康技术公司),ECP3000三恒电泳仪(北京六一仪器厂), 756p紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。1.2 粗酶液制备

发酵培养基:葡萄糖12%、磷酸氢二铵0 4%、磷酸二氢钾0 2%、硫酸镁0 2%、碳酸钙1%、吐温-801%,制备7L液态发酵培养基,接种浓度104个 mL,30 4d达产酶高峰[6]。纱布过滤,菌丝体研磨,用磷酸缓冲液浸酶提取胞内酶,即为粗酶液。

1.3 提纯方法

粗酶液经过浓缩、硫酸铵分级盐析及Sephadex G-25脱盐、离子交换层析、分子筛层析,收集蛋白洗脱液,进行PAGE电泳纯度鉴定[7]。

1.4 酶学性质研究

1.4.1 分子量测定 SDS-PAGE法垂直板测定分子量,浓缩胶浓度4%,分离胶浓度10%;浓缩胶电压100V,分离胶电压200V。低分子量标准蛋白1.4.2 酶蛋白含糖量的测定 硫酸苯酚法,以葡萄糖为标准,作标准曲线。取1mL待测样品,加入1mL6%苯酚及5m L浓硫酸,静置10min,在490nm测吸光值[9]。

糖含量(%)=

葡萄糖含量(mg) 0 9

蛋白含量(mg)+葡萄糖含量(mg) 0 9

100%

1.4.3 pH对酶活性的影响 固定温度30 ,设定3~8pH梯度,以0 5为1梯度,测定各个pH下酶活,进一步缩小pH梯度与范围,直至确定其最适pH。

1.4.4 pH稳定性 将酶液在4~8的pH梯度下, 30 保温48h,测定残余酶活。

1.4.5 温度对酶活性的影响 固定pH6.0,设定温度梯度30~60 ,测定酶活。

1.4.6 热稳定性 将酶液在20~60 温度下保温70min,测定残余酶活。

1.4.7 金属离子对酶活的影响 在酶反应液中加入不同的金属离子,使其终浓度为4mmol L,而亚硫酸氢钠、去氧胆酸钠和SDS终浓度为0 2%。测酶活,并以未加入金属离子的酶活对照。

1.4.8 酶蛋白动力学常数 在30 下,固定酶的量,以不同浓度的葡萄糖溶液为底物,测定酶的反应速度。采用双倒数作图法,测定酶对葡萄糖的Km、Vm值。

1.5 分析测定方法

1.5.1 可溶性蛋白测定 考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量[9]。

1.5.2 酶活测定方法 参照文献[10-12]等报道的方法,取适当稀释酶液50 L,加入2 0m L蒸馏水,400 L4-氨基安替吡啉、辣根过氧化物酶、葡萄糖混合溶液及50 L苯酚作底物,在30 , 505nm下测定其动态吸光值。将相同稀释的酶液预先灭活后做同样的处理作为空白对照。在上述条件下每分钟氧化1 mol葡萄糖产生葡萄糖酸和H2O2所需的酶量即为1个酶活力单位(U)。

参照U hm等报道的方法[13]加以改进,取适当稀释酶液50 L,加入450 L0 04%的葡萄糖, 30 摇床反应2h,沸水浴5min快速灭活,迅速冷却,加入500 L蒸馏水,采用Somogyi-Nelson方法测定还原糖;用相同稀释的酶液预先灭活后,在上述完全相同条件下作对照。在上述条件下每分钟消

70 河北农

耗1 mol 葡萄糖的量即为2 结果与分析

2.1 葡萄糖氧化酶的纯化

1、2、3、4:Sephadex G-100酶液

图1 PAGE 电泳

Fig.1 PAGE Electrophoresis 黑曲霉A9菌株发酵制得粗酶液,然后经过浓缩、硫酸铵分级盐

析及Sephadex G -25脱盐、离子交换层析、Sephadex G -100分子筛层析,收集蛋白洗脱液,进行PAGE 电泳纯度鉴定,如图1所示,分

子筛层析后的酶液表现为一条带,经切胶,测定酶活,这条蛋白带表现为葡萄糖氧化酶的活力。2.2 酶的基本性质

2.2.1 分子量测定 经过SDS-PAGE 测定,黑曲霉葡萄糖氧化酶的分子量为138200Da(如图2)。加巯基乙醇的酶蛋白显示1条带,而未加巯基乙醇的酶蛋白显示两条带。由于在加热处理样品的过程中空气中存在有还原性的物质使部分酶蛋白间的二硫键断开,所以未加巯基乙醇的3、4、5电泳道显示两条带,第1条带为纯酶,第2条带为断开的亚基,且与1道电泳带位于相同的电泳位置。由此可见,该酶是由相同的2个亚基组成。

1.加巯基乙醇的酶液;

2.蛋白质标样;

3、4、5.未加巯基乙醇的酶液

图2 酶蛋白SDS-PAGE 电泳图Fig.2 SDS-PAGE Electrophoresis

2.2.2 酶的糖基化程度 经硫酸-苯酚法测定,葡萄糖氧化酶的糖基化程度为2 67%,糖含量很低。2.2.3 酶的最适pH 由于4-氨基安替吡啉-苯酚显色法测酶活,辣根过氧化物酶对测定有一定的影响,所以采用Uhm

[13]

等报道的方法测定葡萄糖氧化

酶的活性(以下2.2.4~ 2.2.7均采用此方法测定酶

图3 pH 对酶活性的影响

Fig.3 The effect of pH on activity of enzyme

图4 酶的最适pH

Fig.4 The optimal pH of enzyme

2.2.4 酶的pH 稳定性 如图5,酶的pH 稳定范围较宽,在pH 4 0~8 0范围内较稳定。酶蛋白在pH 5 0~5 5酶活基本不变,在pH 6 0~8 0范围内也较稳定,酶活力均保持在72%以上。(注:对照原酶液测定条件为pH 6,温度为30 ,不保温,直接测定酶活力)

图5 酶的pH 稳定性

Fig.5 The pH stability of enzym e

2.2.5 酶的最适温度 如图6所示,最适温度为30 。20 下酶活为最适活性的85 6%,40 下降至最适酶活的72 2%,随着温度的升高酶活下降显著,至60 只剩下30 8%的酶活。

71

第4期

图6 温度对酶活性的影响

Fig.6 The eff ect of temperature on activity of enzyme

2.2.6 热稳定性 如图7所示,酶蛋白在20~50 范围内热稳定性很好,30 处比原酶活力上升了16%,可能是温度对酶活性基团存在一定影响作用。60 时酶活下降至51 4%,70 下降更显著(注:对照原酶液测定条件为pH 5 6,温度为30 ,不保温,直接测定酶活力)

。

图7 酶的热稳定性

Fig.7 The therm al stability of enzym e

2.2.7 金属离子对酶活的影响 如图8所示,该酶

不受EDTA 、SDS 阻抑,但Ag +、Hg 2+

、亚硫酸氢钠则对酶蛋白有强烈的抑制作用,阻抑作用最明显。Ca 2+、Na +、M g 2+、Zn 2+等有一定的激活作用,而Cu 2+、Fe 2+表现稍微的抑制作用,可见这对于测定血糖含量的影响不是很明显(注:对照酶液测定条件为pH 5 6,温度为30 ,未加金属离子,直接测定酶活力)

。

图8 金属离子的影响

Fig.8 The ef fect of ion on activity of enzyme

2.

2.8 酶蛋白动力学常数 以0 05%~0 35%的

葡萄糖溶液为底物梯度,测定酶的反应速度。采用

双倒数作图法,如图9所示,得葡萄糖氧化酶对葡萄糖的Vm 值为35 71 mol m in,Km 值为35 74mmol L 。

图9 葡萄糖Km 值

Fig.9 The value of Km for glucose

3 讨论

有关文献报道黑曲霉葡萄糖氧化酶的分子量150000Da 左右,如果用(-巯基乙醇裂开酶分子中的二硫键,则产生2个分子量各为80000的亚基[1]

,本试验纯化所得的酶的分子量为138200Da,亚基的分子量为70210Da,稍小于报道的值。

酶蛋白的最适pH 接近中性,而报道的值一般在5 6~6 0之间,pH 接近中性的性质使得该酶更适用在一些pH 高的工业中应用。有关文献报道,如果没有葡萄糖等保护剂的存在,pH>8或pH <2,葡萄糖氧化酶将迅速失活。测定此纯化的酶蛋白在pH 4 0~8 0范围内较稳定,其pH 稳定范围较宽。在pH 8 0时酶活力保持在72%以上,可见此酶在碱性条件下酶活力还相当高,这比报道的葡萄糖氧化酶的作用pH 高,并且其耐受性良好,这极有利于工业应用。本试验所提纯的酶的最适温度为30 ,为常温酶,与人的体温相近,所以在血糖的测定中具有良好的应用价值。有关文献报道黑曲霉葡萄糖氧化酶在温度超过40 酶不稳定,酶活将迅速丧失[1]

。而本试验提纯的酶的热稳定性良好,在50 条件下活性基本保持不变,60 下还保存有近50%的酶活力,可见此酶比报道的酶的热稳定性高很多,可高温应用,工业上应用葡萄糖氧化酶时,其热稳定性相当重要,特别是在食品工业中采用各种不同的灭菌条件很重要,而且温度高还可以有效防止杂菌污染,所以提取的酶蛋白有更广泛的应用价值。

该酶不受EDTA 、SDS 阻抑,而Cu 2+、Fe 2+

则表

现稍微的抑制作用,此外,Ca 2+、Na +、Mg 2+、Zn 2+

等对酶有一定的激活作用,可见葡萄糖氧化酶表现的这些性质对于测定含有上述离子的样品时影响不明显,如血糖含量的测定,所以此酶可广泛应用于血糖含量的测定。(下转第83页)

72

河北农业大学学报第29卷

鸡过度消耗体储也是肉鸡体重下降的重要原因。上述结果提示人们,在炎热夏季治疗患大肠杆菌病肉鸡时除合理应用抗生素外,尤其在发病1~3d要加强饲养管理,减少饲料供给量,同时给肉鸡防热应激药物、增强抗热应激能力。在发病4d后开始采食时要适量饲喂,并给予营养全价的饲料,以增强机体[7] 周杰.高温对肉用仔鸡生产性能和某些血清生化指标

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(编辑:李 川)

(上接第72页)

此酶对葡萄糖的Km值为35 74mmol L,比报道的商品酶38 25mmol L低。由于Km值表征的是酶与底物亲和力的大小,可见该酶对葡萄糖的亲和力大于报道的商品酶。

因此黑曲霉葡萄糖氧化酶具有潜在的应用价值,并且黑曲霉是具有GRAS资格的安全菌株,最适合于在食品、医药等工业中应用。

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(编辑:梁 虹)