杂交瘤技术的实验原理

酶联免疫吸附法(ELISA)
技术原理：
有色产物
酶标仪检测
底物 酶
第2抗体 第1抗体 待检杂交瘤培养上清液 抗原
四、克隆化
常用克隆化方法：
有限稀释法
80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells)
软琼脂平板法
显微操作法
ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清， 选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为 单克隆抗体。
单克隆抗体(monoclonal antibody, MAb)
由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对 于 一 个 抗 原 决 定 簇 —— 单 克 隆 抗 体 (monoclonal antibody, MAb)
单克隆抗体优点：
• 高度纯一 • 高度专一
应用：
✓疾病的论断和治疗(生物导弹) ✓生物大分子的鉴定、定位和分离纯化 ✓细胞器的鉴定、定位和分离 ✓特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离
H
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
T
外源性途径(旁路途径)
胸腺嘧啶激酶 ( TK )
(Thymidine kinase)
DNA
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
只有杂交瘤细胞可长期存活下来 分泌 X抗体
规模化培养 获得大量单克隆抗体
杂交瘤技术操作流程图解
抗体纯化
洗脱液
亲 合 层 析 原 理 图 解
支持物 被分离物的抗体
被分离物质
其它物质
五、大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法 细胞培养罐法
动物免疫 BALB/c
X抗原
B淋巴细胞 瘤的突变株
培养上清中X抗体的检测 克隆化培养
分泌X抗体 B淋巴细胞
培养数天后细胞死亡
骨髓瘤细胞 无限生长细胞
细胞融合 混合细胞的HAT筛选)
单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体
骨髓瘤细胞 (myeloma cells):
恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可 永远分裂和存活——长命细胞。
经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞 株——没有抗体分泌物。
2. 细胞融合技术：
分泌抗体 短命 脾细胞 (B淋巴细胞)
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命 杂交瘤细胞
Köhler和Milstein, 1975
1984年Nobel医学奖
3. 杂交瘤细胞的筛选 ：
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞/脾细胞 骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出 不能长期存活
不能长期存活
HAT培养基筛选
H, Fra Baidu bibliotek黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
杂交瘤技术制备单克隆 抗体的实验原理
一、杂交瘤技术产生的3个技术关键
1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：
B淋巴细胞(B lymphocytes)： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性
抗体，在体液免疫中具有重要功能。 B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再
进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命 细胞
存活 死亡
常用免疫方法：
☺常规免疫法 “稳妥；优势克隆” ☺脾内一次性免疫法 “省时；省抗原” ☺短程免疫法 “省时” ☺体外免疫法 “操作繁琐”
免疫途径： 皮下注射 腹腔注射 静脉注射
常规免疫法：
第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射) 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射)
第3次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (静脉注射)
2、HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
三、抗体的检测
常用方法：
要求：
➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法
二、细胞融合及HAT筛选
1、细胞融合方法：
病毒介导的细胞融合 PEG介导细胞融合 电激融合
细胞悬液的制备与融合
(1) 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 (3) 细胞融合：50%PEG(1000~4000), pH8.0, 38oC, 1min