盐酸克伦特罗

摘要
盐酸克伦特罗酶联免疫反应适用于尿样、组织和饲料等样品中克伦特罗残留的量检测，是一项筛查盐酸克伦特罗残留的新技术。

克伦特罗作为一种主要的β- 兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中, 用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。

由于克伦特罗可作为肌肉舒缓剂用于人类疾病治疗, 在畜禽中过量残留可能会对消费者造成危害, 为此, 被禁止在食品生产中应用。

由于该检测方法技术性强，对试验环境要求特殊，因此影响ELISA检测质量的因素有很多，如试剂因素、标本因素和操作因素等。

试剂的质量固然是影响检测结果准确性的关键因素,然而检测人员的操作是否规范合理对ELISA检测结果的影响也不可忽视。

本论文就ELISA法检测猪的肝脏中盐酸克伦特罗含量以及试剂的选择、温育条件、洗涤次数、准确加样、显色时间等多个操作因素对检测结果产生的影响进行了分析并针对性的提出了相应的控制对策，从而为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速的检测盐酸克伦特罗残留的方法。

关键词：酶联免疫；检测；盐酸克伦特罗；关键控制因素
摘要应该改为：
本论文就ELISA法检测猪的肝脏中盐酸克伦特罗含量以及试剂的选择、温育条件、洗涤次数、准确加样、显色时间等多个操作因素对检测结果产生的影响进行分析，针对性的提出了相应的控制对策，从而为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速的检测盐酸克伦特罗残留的方法。

试验结果表明，、、、、、、
Abstract
Clenbuterol hydrochloride enzyme-linked immune response is applicable to urine, fodder and other groups and the amount of clenbuterol residues in the sample testing, clenbuterol hydrochloride residue is a screening of the new technology. Clenbuterol, as a main beta stimulants used in products production, to increase the proportion of muscle and fat and speed up the growth. Because of clenbuterol can be used as a muscle relieving agent in human disease treatment, in livestock and poultry excessive residues may cause harm to consumers, therefore, have been banned in food production in the application. Because the test method of technical and special requirement to the test environment, so that the influencing factors on the quality of the ELISA detection has a lot of, such as reagents, specimen and operating factors. Reagent is the quality of the key factors influencing the accuracy of the test results, however, check whether the operation of the personnel specification is reasonable on the result of ELISA detection also cannot be ignored. This thesis just ELISA method to detect clenbuterol hydrochloride content in pig's liver, as well as the choice of reagent, temperature condition, washing frequency, accurate sample and chromogenic time multiple operating factors on the impact of test results are analyzed and put forward the corresponding control countermeasures, which provides the farmers and the government supervision and regulation department more accurate rapid detection of clenbuterol hydrochloride residue method.
Key words:enzyme-linked immune；Detection；Clenbuterol hydrochloride；The key control factors
一、引言
1.1 文献综述
盐酸克伦特罗酶联免疫反应测试盒适用于尿样、组织和饲料等样品中克伦特罗残留的量检测。

克伦特罗作为一种主要的β- 兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中, 用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。

由于克伦特罗可作为肌肉舒缓剂用于人类疾病治疗, 在畜禽中过量残留可能会对消费者造成危害, 为此, 被禁止在食品生产中应用。

根据美国 FDA 和WHO 规定, 在肌肉和脂肪中克伦特罗的含量不能超过 0.2 ng/g, 在肝脏和肾脏中其含量不能超过 0.6 ng/g。

与传统的 HPLC或 GC- MS 方法相比,酶联免疫方法具有操作简便、灵敏度高、成本低的优点。

盐酸克伦特罗酶朕免疫反应测试盒为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速检测克伦特罗残留的方法, 该试剂盒的特点包括 4 方面, 第一, 该试剂盒的提取方法能达到 75 %～95 %以上的回收率, 可以不需用有机溶剂并在10～30 min 之内完成提取过程。

第二, 高灵敏度(0.05 ng/g); 低检测下限(肉类/ 脂肪 0.025 ng/g, 尿液 0.05 ng/ml, 饲料 0.2 μg/kg)。

第三, 检测过程只需不到 2 h。

第四, 高重复性。

食品安全问题是目前全球范围内的焦点和热点之一,猪肉中盐酸克伦特罗残留危害事件曾触目惊心[2]。

筛查兽药盐酸克伦特罗残留,是畜禽产品质量安全检测时的必检项目。

目前国内外用于检测动物性食品中盐酸克伦特罗的方法主要有色谱检测技术，但这类方法对检测设备、环境条件、操作技能要求高，检测周期长，价格昂贵，不方便普及。

另一类检测方法是免疫分析技术，其中的酶联免疫吸附试验(ELISA)是快速筛查盐酸克伦特罗残留的标准方法之一[3]。

但是该方法技术性强，操作过程复杂，对试验环境要求特殊，检验时稍有不慎，就会产生许多失误,导致误检或漏检[4]。

为了提高工作效率,确保检测质量,根据盐酸克伦特罗的生物学特性,针对应用ELISA检测畜禽产品残留时易产生的失误,提出了相应的控制对策, 以减少检测工作的失误。

本实验利用酶联免疫法检测猪肝中盐酸克伦特罗的残留量以及对影响本实验结果的关键控制因素进行了分析，从而为人类食用到安全放心肉提供了一个快速、高效的检测方法。

修改意见：请将第一段和第二段糅合在一起，显示出层次感和条理性。

1.1.1 基本生物学特性
1.1.1.1 理化性质
盐酸克伦特罗(Clenbuterol, CL) 是一种平喘药的商品名, 又称氨哮素、克喘素, 化学名称为羟甲叔丁肾上腺素, 或2- [(叔丁氨基)甲基]- 4- 氨基- 3, 5- 二氯苯甲醇盐酸盐，药品名为双氯醇胺、舒喘宁、克喘素等［5］。

中文名称有: 瘦肉精、克伦特罗、盐酸克伦特罗、盐酸双氯醇胺、克喘素、氨哮素、氨必妥、氨双氯喘通和氨双氯醇胺。

英文名称有: Clenbuterol、Spiropent、Planipart、NAB365、4- Amino- 3, 5- dichloro- alpha- {[(1,1- dimethylethyl)amino]m ethyl} benzenemethanol。

CAS号: 37148- 27- 9。

分子式: C12- H18- Cl2- N2- O。

其理化特性为白色或类白色的结晶粉末, 无臭、味苦, 熔点 161℃, 溶于水、乙醇, 微溶于丙酮, 不溶于乙醚。

盐酸克伦特罗为人工合成的β2受体激动剂［6］，其化学性质稳定，一般方法不能将其破坏，加热到 172 ℃才能分解［7］。

CL 是儿茶酚胺化学合成的一种衍生物，属于苯乙胺类(PEAs)药物，在体内不会破坏分解，以原形排出体外［8］。

CL 对支气管平滑肌受体有较好的选择性兴奋作用，缓解由于过敏性反应引起的支气管痉挛和黏膜充血、水肿而发挥平喘作用。

CL 还有能量重新分配的作用，促进脂肪分解和蛋白质的合成，从而实现动物营养再分配，使得畜禽生长速度增快，瘦肉大大提高［9］，因此俗称为“瘦肉精”。

在临床上以盐酸盐剂型曾用于治疗牲畜支气管哮喘、难产等病症。

通常每日用药量小于1/kg,连续用药时间少于10d。

当人体摄入剂量超过0.1ug/g残留的畜禽内脏组织时,便会出现一些明显的中毒症状,如肌肉震颤、行走不稳、手握无力、心动过速、心律失常、腹痛、恶心、眩晕等[2]。

1.1.1.2 盐酸克伦特罗毒理分析
盐酸克伦特罗毒理是, 克伦特罗能激动β2- 受体, 对心脏有兴奋作用, 对支气管平滑肌有较强而持久的扩张作用, 口服后较易经胃肠道吸收。

该药物可选择性地作用于肾上腺素受体, 是一种强效激动剂, 可引起交感神经兴奋, 在药物剂量下, 具有松弛气管平滑肌作用, 用于治疗支气管炎、肺气肿等引起的哮喘。

20 世纪 80 年代初,美国一家公司意外地发现, 将一定量的盐酸克伦特罗药物添加在饲料中, 可明显促进动物生长, 并增加瘦肉率。

随后, 这一新发现在一些国家被应用于养殖业。

盐酸克伦特罗进入体内后具有分布快、消除慢的特点, 能够改变营养的代谢途径, 促进动物肌肉、特别是骨骼肌蛋白质的合成, 抑制脂肪的合成和积累, 从而使生长速度加快、瘦肉相对增加[17]。

一般来说, 饲料中
添加适量盐酸克伦特罗后, 可使饲料转化率、生长速率、酮体瘦肉率提高10%以上, 所以也称它为“瘦肉精”[11-13]。

基于食用动物内脏而导致的中毒事件的不断发生, 欧盟很快作出了反映:严禁在饲料中添加盐酸克伦特罗类药物。

美国食品与药品管理局(FDA) 也将肉品中的盐酸克伦特罗残留作为必检项目。

至此, “瘦肉精”在动物生产与饲料加工中全面被禁止使用。

近年来, 动物性产品中盐酸克伦特罗残留对人类健康造成的危害和对生态食物链所造成的破坏已经引起各国高度的重视[10]。

为了保证猪肉产品质量安全,保护人类健康,许多国家都禁止在食用动物源性的生产中使用盐酸克伦特罗[14]。

1.1.2 盐酸克伦特罗残留分析：
盐酸克伦特罗化学性质稳定,易在动物肝、肾、肺、肌肉、毛发等组织和器官中蓄积;主要发生各种氧化代谢和轭合反应,在代谢过程中受转移酶、芳基硫酸化酶的作用,生成葡萄糖醛酸轭合物失活,故残留监测只检盐酸克伦特罗原型。

目前,国内外检测畜产品中盐酸克伦特罗残留常用的检测方法有:HPLC(高效液相色谱)法、GC-Ms(气相-质普联用仪)法、LC-MS(液相-质普联用仪)法、ELISA(酶联免疫吸附试验法)法等。

通常检测限要求低于0.5Lg/kg。

国内相关标准的规定是,用ELISA法进行筛查,GC-Ms等方法加以确证[15]。

本试剂盒采用ELISA(酶联免疫吸附试验法)可用于定量、定性检测饲料、动物尿液以及动物组织等样品中盐酸克伦特罗的残留。

1.1.3 盐酸克伦特罗的危害性
1.1.3.1 对猪的影响
在饲用初期猪会在短期内出现血压升高、血管扩张、呼吸加剧、体温上升等症状,并出现采食下降、行为动作失调、神经紧张不安甚至全身震颤等症状。

后期会使猪体内糖降解作用不足,导致猪肉品质下降,同时容易发生蹄损伤和跛行,大运动量或高温条件会造成死亡。

1.1.3.2 对人的影响
人食用含残留盐酸克伦特罗猪肉后对肝、肾等内脏器官会产生毒害作用,出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状,特别是对高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大,严重的可导致死亡。

1.1.4 国内外对盐酸克伦特罗的禁用规定
由于盐酸克伦特罗对猪具有加强脂肪分解,促进蛋白质合成,实现动物营养再分配,提高胴体瘦肉率,加快猪的生长等作用,盐酸克伦特罗曾作为科研成果推广,从而使多起摄入残留“瘦肉精”的消费者中毒案件发生,严重的甚至导致了死亡。

就国内而言,自1998年以来，每年都有数起类似中毒事件发生。

今年双汇“瘦肉精”事件更是引起了广泛的关注[12]。

从1986年开始,欧美等发达国家已严禁畜牧生产中应用盐酸克伦特罗,我国农业部在1997年3月以[农牧发(1997)3号文]严令禁止β一肾上腺素类激动剂在动物生产中的应用。

美国食品药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)建议CLB在动物组织中最高残留限量(MRL)分别为：肉0.2μg／kg，肝0.6μg／kg，肾0.6μg／kg，脂肪 0.2μg／kg，奶 0.05 ug /kg。

我国政府一方面加强法律法规的建设,同时也加强对饲料安全及生猪生产中应用违禁药物的查处工作。

2001年9月,农业部颁布行业标准NY/T468200l((动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱一质谱法》,规定了以气相色谱一质谱(GC/MS)法测定动物组织中盐酸克伦特罗残留的方法,适用于动物肝脏组织中盐酸克伦特罗的测定。

该方法的最低检出限量为2ug/kg。

2001年10月,农业部颁布农牧发[2001〕38号《猪尿液中克伦特罗检测方法—酶联免疫吸附测定法》的行业标准,规定了猪尿液中克伦特罗检验的制样和酶联免疫吸附测定方法(ELISA),适用于猪尿液中克伦特罗的残留常规快速筛选检测,规定检测结果小于1.0ug/L时可判为未检出,大于1.0ug/L时判为可疑,需用GC/MS法确证[16]。

1.1.5 酶联免疫分析技术(EIA）及方法
1.1.5.1 酶联免疫分析技术
酶联免疫分析技术是“迈向 21 世纪的医学检验技术”之一, 其发展趋势是: 新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术, 可明显提高检测特异性, 灵敏度可达 ug/ml 水平, 即可实现分子水平的检测。

目前, 检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析技术是ELISA 技术。

ELISA 法可对动物尿液和血清中的β- 兴奋剂残留进行直接分析, 该方法既适于实验室大量样品的检测, 也适于屠宰场地大量样品的迅速检测。

美国、英国和德国的公司均开发出了检测肉品、饲料中 CLB 残留的 ELISA 试剂盒。

中国在应用 EIA 检测 CLB 方面的研究起步晚, 但近几年取得了明显的进展, 目前已有几种试剂盒研制开发成功。

ELISA 检测试剂盒优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速、价格便宜。

1.1.5.2 酶联免疫法
酶联免疫法是微孔板加入盐酸克伦特罗抗体,经过孵育及洗涤步骤后,加入盐酸克伦特罗酶标记物、标准和样品溶液。

盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗酶标记物竞争,盐酸克伦特罗抗结合的盐酸克伦特罗酶标记物在洗涤步骤中被除去。

将酶基质和发色剂加入到孔中并且孵育。

结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。

加入终止液后由蓝色转化为黄色,在450nm处测量吸光强度,吸光值与样品中盐酸克伦特罗浓度呈反比[21]。

目前,国内用于盐酸克伦特罗残留检测的试剂盒已经商品化,具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单等优点,适于批量样品的快速分析测定．检测精度可达ng／mL级,此法假阳性率较少。

1.2 选题依据：
随着人民生活水平的日益提高，对动物产品的要求已从数量型向质量型转变，动物产品的内在品质安全越来越受到重视，倡导绿色消费的呼声亦越来越高。

但一些动物养殖经营者为追求经济利益，在动物饲料中使用违禁添加剂如盐酸克伦特罗等，严重威胁着广大消费者的身体健康。

盐酸克伦特罗(CLB) 易残留在动物组织中,人食用后会对肝、肾等内脏器官产生毒害, 出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状, 严重者甚至死亡。

虽然盐酸克伦特罗残留的毒作用为轻度, 但美国 FDA 研究表明, 应用拟交感神经药者或对前药过敏者, 对盐酸克伦特罗的反应要比正常健康个体更为严重[1]。

因此，为了确保人类的健康和安全，加强食品中“瘦肉精”残留的监督和检测显得尤为重要。

各国政府和相关组织都大力加强防范和治理措施，为人类能够食用到安全、无污染的肉质产品做出应有的贡献。

二、实验部分
2.1 实验原理
ELISA检测盐酸克伦特罗的反应原理是:酶标微孔板上包埋有针对盐酸克伦特罗抗体(IgG)的双抗体,加入IgG经过孵育及洗涤后,再加入受检抗原和酶标抗原,竞争性地与酶标微孔板上已连接在双抗体上的抗体相结合。

如受检样品中无抗原盐酸克伦特罗,则酶标抗原便与该抗体全部结合,如果受检样品中含有该物质,则可和酶标抗原竞争该抗体,二者占领的机会是均的。

如果检测样品中含有盐酸克伦克罗,便会占领酶标板上连接的双抗体,而酶标抗原便无法和孔板上双抗体结合,就会被水冲掉,孔板上不会显色[4]。

加入脲酶底物显色后,含结合酶标量的颜色最深,含单一抗原量大的样品颜色最浅。

其颜色的深浅和盐酸克伦特罗的
含量呈负相关。

参比孔(空白)和待测样品孔颜色之差,就代表了受检样本所含抗原(盐酸克伦特罗)的量。

和标准样板孔的颜色比较,进行定性,用浓度吸光度值进行定量。

整个试验结果,同处理(平行)板孔之间显色应该一样,空白样上应该颜色最深,标准对照(质控样)上应该颜色最淡。

2.2 实验材料和实验试剂
2.2.1 试剂盒组分
、、、
包被有盐酸克伦特罗抗体的微孔板96孔（8孔/条*12条）
盐酸克伦特罗标准溶液6瓶（1.0ml/瓶）
分别为0号：0ug/L；1号：0.1ug/L；2号：0.3ug/L；3号：0.9ug/L；4号：2.7ug/L；5号：8.1ug/L；
10*浓缩洗涤液1瓶（30ml）、盐酸克伦特罗标记HRP溶液1瓶（7ml）
底物溶液A 1瓶（7ml）、底物溶液B 1瓶（7ml）
终止液 1瓶（7ml）、封板膜 3张、说明书 1张
试剂盒的保存
试剂盒应当在 2～8℃的温度下储存, 有效期为 1 年。

2.2.2 实验材料和试剂
采自伊宁市超市的新鲜的猪的肝脏，实验过程中所使用试剂及配置方法如下：
（1）0．01M PBS(PH 5.5-6.0)
称取8g氯化钠，2.9g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加超纯水溶解，调PH至 5.5-6.0，定容至1000ml。

(2) 0.1M 盐酸溶液和0.05M 盐酸溶液
取1ml盐酸（36%-38%），加超纯水定容至119ml,即为0.1M 盐酸溶液。

将0.1M 盐酸用超纯水稀释1倍即为0.05M 盐酸溶液。

(3) 1M 氢氧化钠溶液
称取4g氢氧化钠，加超纯水溶解后定容至100ml。

（4）0.5M 磷酸二氢钾缓冲液（PH 3.0）
称取6.8g磷酸二氢钾加入80ml超纯水定容后，用磷酸调节PH至 3.0，加超纯水溶解后定容至100ml。

(5)4% 氯化钠溶液
称取4g氯化钠加去离子水混匀定容至100ml。

（6）4% 氯化钠-0.1M 盐酸混合液
量取70ml 4% 氯化钠溶液、20ml 0.1M 盐酸溶液和10ml超纯水混匀。

2.3 实验仪器
微孔板酶标仪（450nm）、天平（精度0.01g）、匀浆器、振荡器、离心机和离心管、针筒式微孔过滤膜（0.45um）、可调式20uL-200uL和100uL-1000uL微量移液器.
2.4 实验方法（简易法）
2.4.1 实验样品的采集和处理
（1）采样及处理。

实验样品采自于伊宁市超市的新鲜的猪的肝脏，将样品切成小块放入匀浆器中进行搅拌，使之成为匀浆液。

（2）称取2g均质样品于50ml离心管中，加入6ml 4% 氯化钠-0.1M 盐酸混合液，最大转速震荡3分钟，室温静置20分钟；
（3）5000rpm离心10分钟。

取1ml上清液加入约20uL 1M氢氧化钠调节PH
5.5-
6.0之间，取50uL进行检测。

2.4.2 操作流程
（1）试剂准备。

将10*浓缩洗涤液和蒸馏水（或去离子水）按1:9充分混匀，即为1*洗涤液。

（2）编号。

将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔按序编号，建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。

（3）加样。

加入标准溶液或样品50uL，然后每孔分别加入盐酸克伦特罗标记的HRP溶液50uL.
（4）温育。

轻轻震荡混匀，用封板膜封板后置于室温（20-25℃）反应30分钟。

（5）洗涤。

小心揭开封板膜，每孔加入1*洗涤液250uL洗涤微孔板，连续洗板3次，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。

(6) 显色。

将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合，振荡混匀，每孔加入100ml，室温（20-25℃）避光显色15-20分钟。

（7）测定。

每孔加入终止液50uL，轻轻振荡混匀，5分钟内测定450nm处吸光度值。

2.4.3 盐酸克伦特罗含量计算
2.4.
3.1 百分吸光度值（B/B。

）
所获得的标准溶液或待测样品的吸光度值除以0号标准溶液的吸光度值（B。

）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）=B/B。

*100%
式中： B —标准溶液或待测样品溶液的吸光度值。

B。

— 0号标准溶液的吸光度值。

2.4.
3.2 绘制标准曲线
以盐酸克伦特罗标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。

相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出盐酸克伦特罗浓度。

也可以用回归方程法，计算出样品中盐酸克伦特罗的浓度。

盐酸克伦特罗实际含量（ug/kg）=C*D
式中: C—稀释后样品提取液中盐酸克伦特罗含量（ug/L）。

D—样品稀释倍数。

注：为获得样品中盐酸克伦特罗的实际含量（ug/kg），从标准曲线上读出的浓度应当乘以相应的稀释倍数。

三、结果与讨论
3.1 ELISA检测结果及关键控制因素分析
3.1.1 检测结果计算与分析
（1）百分吸光度值计算（B/B。

）
所获得的标准溶液或待测样品的吸光度值除以0号标准溶液的吸光度值（B。

）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）=B/B。

*100%
式中： B —标准溶液或待测样品溶液的吸光度值。

B。

— 0号标准溶液的吸光度值。

表3-1 标准溶液或待测样品的吸光度值
A B C D E F G H
1.814 1.189 1.146 0.914 0.706 0.182 1.072 1.031
表中：A-F 分别表示0号-5号标准溶液的吸光度值。

G、H 分别表示待测样品1和待测样品2的吸光度值。

标准溶液或待测样品百分吸光度值：
标准溶液1（%）= B1/B。

*100%=65.5%
标准溶液2（%）= B2/B。

*100%=63.2%
标准溶液3（%）= B3/B。

*100%=50.4%
标准溶液4（%）= B4/B。

*100%=38.9%
标准溶液5（%）= B5/B。

*100%=10.0%
待测样品1（%）= Ba/B。

*100%=59.1%
待测样品2（%）= Bb/B。

*100%=60.2%
（2）绘制标准曲线，计算盐酸克伦特罗含量
以盐酸克伦特罗标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，绘制如
下标准曲线。

图1-1 标准曲线
由方程得知：R=0.9566 ；斜率=6.6219；截距=61.625
根据样品1和样品2的百分吸光度值可计算得出其浓度分别为：
C1=0.381 ug/L；C2=0.215 ug/L
盐酸克伦特罗实际含量:
m1（ug/kg）=C*D=0.381 ug/kg
M2（ug/kg）=C*D=0.215 ug/kg
式中: C—稀释后样品提取液中盐酸克伦特罗含量（ug/L）。

D—样品稀释倍数为1倍。

分析：与规定的动物肝脏中最高残留量0.6 ug/kg相比，m1、m2均小于0.6ug/kg，因此检测样品1和样品2中盐酸克伦特罗含量正常，可安全放心食用。

3.1.2 关键控制因素分析
由于ELISA检测范围在ng至pg水平,属于超微量分析技术,因此对试剂、材料、试验过程和反应条件都有严格的要求。

3.1.2.1 准备过程中需控制的因素
(1) 样品的采集、处理和保存方法。

在伊宁市超市随机采集新鲜、无污染的猪的肝脏样品,自然放置1-2h, 切成小块后放入匀浆机中绞碎装入保鲜袋中。

5d 内测定的肝脏样品在 4 ℃的冷藏柜中存放，一周后测定的样品需在-20 ℃低温冷冻冰柜中存放。

样品避免反复冻融，剩余立即放回冰柜保存。

（2）试剂选择。

试剂的优劣直接决定检测结果的成败。

目前市场上试剂种类繁多，要选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、易于操作的优良检测试剂。

化验室应根据化验量有计划购买，避免一次性大量购买，造成不必要的浪费。

化验前要检查并确认产品批号、生产日期及有效期。

平时储存应以2 ℃ ~ 8 ℃为宜，既不能在室温下长期放置也不能冷冻。

对于未使用完的试剂和微孔板等生物材料,必须于2~8℃密封保存。

微孔板不能重复使用。

对于缓冲液、洗涤剂、样本稀释液等辅助性试剂的配制,应随用随配。

(3) 购买和储存酶标板。

要注意控制好环境的温度、湿度,即刻在冰箱2~8℃环境中密封干燥保存并且注意不要错过了质保期。

3.1.2.2 ELISA 操作过程中需控制的因素
（1）准备工作。

在实验开始前，先将试剂从冰箱中取出放在室温下平衡。

时间至少30 min，时间不够会导致弱阳性标本呈假阴性。

试剂盒中不需要用的部分要及时放回冰箱保存。

（2）做好计划。

试剂平衡的时间内，仔细阅读说明书并熟悉操作流程。

对实验中需要的设备、仪器及需要配制的液体做到心中有数，然后制定详细的计划，细化操作流程中的步骤。

做好准备工作是保证化验一气呵成的重要环节，实验一旦开始，就要连续不间断，避免因中途考虑不周手忙脚乱增加人为误差，对实验结果造成不可逆转的影响。

（3）科学合理的试验设计。

试验必须设重复,用来消除试验误差。

所有工作试剂要随配随用, 切勿久贮,因浓度偏低易失活易污染。

每次试验,每块酶标板都必须要有加标对照和空白对照;其排放位置应尽量避开微孔板条的2个边行,不允许缺项或少项[18]。

（4）试剂要求。

配制洗涤液要现用现配，确保所用容器无菌，用新鲜的蒸馏水或高质量的纯化水配制。

洗涤液如果结晶，应使其充分溶解后再配制。

蒸馏水的质量至关重要, 不合格的蒸馏水能使空白值升高,必须使用新鲜的双蒸水或超纯水制备试剂[4]。

（5）加样。

在 ELISA 操作的核心环节是加样。

有5 个步骤，分别是：加样品稀释液，加待测样品，加酶标试剂，加显色剂，加终止液。

在加样时应注意四个方面：①加样前要反复确认要加的液体和量，每次要看清取用试剂的标签，检查移液器是否调整好相应的加样量，再操作。

②微量加样的精确程度会很大程度地影响检测结果。

加样时速度要慢、位置要准。

要将吸嘴伸入孔中，加在孔底部，悬在孔外加容易污染邻孔或滴附在孔壁上而导致加样量不准。

加显色剂时，用多道微量加样器能在较短时间内快速完成加样，减小误差。

③加样时要思想集中，不聊天、不谈笑。

包被板下面垫好序号纸，确保不错加、不漏加、不重复加样。

④由于吸嘴难以清洗干净，且易残留杂物，为保证吸量准确、减少交叉污染的机会，应使用一次性吸嘴。

（6）适温孵育(培养)。

孵育时,由于ELISA试验一般都有二次抗原抗体反应,应注意使各ELISA条板的温度迅速平衡,其目的是恢复其生物活性,保证充分反应。

孵育时,要贴封片或加盖,防止阳性样品液体蒸发和空气中污染物进入或放置于下垫干净湿纱布的带盖搪瓷盘中,使样本或稀释液不致蒸发。

（7）细心洗涤。

洗涤是 ELISA 操作中最易被忽视的环节。

ELISA 靠洗涤达到分离、游离和结合酶标记物的目的，通过洗涤清除残留在板孔中未与固相抗原或抗体结合的物质以及反应过程中的干扰物质。

洗涤的次数和置留时间不够会导致假阳性，所以要严格按照时间、次数洗涤。

洗涤时要将洗涤液注满各孔，不要溢出，洗涤 5 次，每次间隔 30 s，每次用力甩净液体，在干净、无尘吸水纸上拍干。

反应板多时，要合理安排时间，避免等待时间过长。

（8) 洗板和摔板。

在洗板时,要避免孔与孔之间液体交叉污染,避免由于洗液。