一株苯胺降解菌的筛选及其降解效率研究

第34卷第2期 2017年6月

苏州科技大学学报（自然科学版）

Journal of Suzhou University of Science and Technology (Natural Science)

Vol.34 No.2

Jun. 2017

一株苯胺降解菌的筛选及其降解效率研究

刁刻，吴琼，邱业先*

(苏州科技大学化学生物与材料工程学院，江苏苏州215009)

摘要：从活性污泥中筛选出一株可高效降解苯胺的细菌，通过扫描电镜观察、PCR法扩增16SrDNA测序和比对、生理生化实验鉴定其种属。结果显示,所筛选的菌株DK为代尔夫特菌属通过正交试验探索其最优生

长条件为:温度30 ^+11=8,摇床转速250 miir1，苯胺浓度0 rng^L-1。菌株DK对苯胺降解效率随着接种量增加而提 髙，随着苯胺浓度的增加而减小。菌株DK在含有1 000 m^L-1苯胺的自来水中3 d后的降解率达到87.4%。为菌株 DK的开发应用奠定了一定基础。

关键词：苯胺；降解;代尔夫特菌属；16SrDNA

中图分类号：X172 文献标志码：A文章编号：2096-3289(2017)02-0043-06

苯胺属于芳香胺类化合物，我国苯胺年生产能力达到两百万吨，广泛应用于印染等化工领域。值得注意 的是，苯胺已对人类和环境造成严重危害,被美国E P A列为优先控制的129种污染物之一I因此，环境中苯 胺降解得到越来越多的关注。微生物降解法因其具有成本较低、无二次污染等优点，成为降解苯胺研究的热 点和重点。目前，国内外苯胺降解研究主要集中在高效降解菌筛选和其降解性能等方面[24]。笔者从污水处理 厂(主要为有机物降解）的活性污泥中筛选到1株以苯胺为唯一碳、氮源生长的细菌，并对其进行生物学鉴定 和降解性能研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料

活性污泥取自苏州某污水处理厂曝气池中;D N A提取试剂盒购自于上海(生工)生物工程公司;T a q酶购 自北京康为世纪生物公司；16S r D N A通用引物由上海(生工)生物工程公司合成;其他所用试剂为国产分析纯。

1.1.2仪器

9700型P C R购自美国A B公司；5417R冷冻离心机购自美国Eppondorf公司；D K Y恒温调速回转式摇床购自上海杜科；水浴锅、G N P9050隔水式恒温培养箱购自上海精宏;S W-CJ-2F D超净工作台购自上海博 讯实业;T U1810紫外/分光光度计购自北京普析;A T B1525半自动细菌检定仪购自法国梅里埃集团公司；Philip X L20扫描电子显微镜购自荷兰飞利浦公司。

1.1.3培养基

富集培养基(W«):葡萄糖0.1%，蛋白胨0.05%,氯化钠0.5%,磷酸氢二钾0.5%,磷酸二氢钾0.3%，硫酸 镁0.05%，调p H值至7.0;无机盐培养基(W r):磷酸二氢钠0.05%,磷酸氢二钾0.05%，硫酸镁0.05%,氯化钙 0.01%,调p H值至7.0。以上培养基均在121 T：灭菌20 min。

[收稿日期]2015-05-20

[基金项目]江苏省科技支撑项目（BE201038)

[作者简介]习刻（1990-)，男，安徽宿州人，硕士研究生,研究方向：环境有益微生物研究与利用。

•通信作者:邱业先（1954-),男，博士，教授，博士生导师,E-mail: qyx542@。

44苏州科技大学学报（自然科学版)2017 年

1.2方法

1.2.1菌种的驯化和筛选

取1m L活性污泥加人苯胺富集培养基(苯胺浓度500 m g^L-1)，摇床培养(30 H60 mirT1)，12 h后待 培养基浑浊，接种到含600 m g^L-1苯胺的富集培养基，连续多次转接，直至接种到含1 000 m g l-1苯胺的富 集培养基中。随后，转接到含1 〇〇〇m g l-1苯胺的无机盐培养基中，摇床培养3 d,并在含1 000 m g，!/1苯胺 的无机盐培养基,重复转接培养3次，确保菌株对苯胺的耐受性不变。最后，将所得菌液涂平板，划线分离纯 化菌种,挑选单菌落纯化培养，并测定每个培养试管中的苯胺降解率，选择出降解率最高的一组，所筛选得到 的菌株编号为D K。表1正交实验因素位级表

1.2.2菌株D K的生长条件测定

以L B培养基为基础培养基，设计菌株D K 生长条件的正交试验。通过正交试验设计，测定 菌株D K培养液2 d后的ODaoo来探究温度、p H 值、摇床转速、苯胺的含量以考察这四个因素对 菌株D K生长的影响。水平条件设计因素位级 表见表1,正交实验表见表2。

1.2.3 菌种D K的观察及鉴定

菌落的观察以及细菌鉴定仪鉴定：在无机 盐培养基中，菌株D K培养60 h后，取100

菌液均匀涂于固体培养基（苯胺含量为1 〇〇〇m g•L-1)，放人恒温培养箱中，待菌落长出，观察 菌落形态。挑取单菌落用于革兰氏鉴定和半自 动细菌检定仪进行生理生化鉴定。

因素温度/丈pH值转速/ mirT1苯胺浓度/mg ■L—1位级1254500

位级23061501000

位级33582502000

表2正交实验表

实验号温度/x pH值转速/ miiT1苯胺浓度/mg * 11111

21222

31333

42123

52231

62312

73132

$3223

9 3 3 11

扫描电镜的观察:接种菌液到新的L B培养基中，过夜培养得到新鲜的菌液。第一步，取一定量的培养液 于8 000 r p m离心机离心4 min,弃上清液,并加人固定液2.5%的戊二醛。第二步，固定，脱水。在固定液戊二醛中浸泡4 h左右，并用磷酸缓冲液冲洗3次，脱水用乙醇梯度分别为30%、50%、75%、85%、95%的乙醇脱水。每个梯度乙醇脱水一次。最后用无水乙醇脱水2次。每次脱水时间大约在20 min。完成后再用乙酸异 戊酯置换2次，每次20 min。之后样品送到苏大扫描电镜实验室进行电镜观察。

16S rDNA序列的测定:收集菌体，提取染色体总DNA作为扩增模板。16S rDNA扩增的PCR反应所用 的引物两端序列分别是 27F和 1492R，5 ’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3,和 5 ’-GGTTACCTTGTTCGACTT- 3’。PCR反应体系（25 j j l L)为 lOxPCR缓冲液 2.5 (xL,dNTP2.5 (xL,引物 0.5 |jl L,模板 DNA 0.5 |xL,Taq 酶 0.2 j j l L,加双蒸水至25 pL。PCR反应程序如下:94 ^预变性4 min，94 ^变性45 s，55 ^退火45 s，72 ^延伸1min，此步骤共进行30个循环，72 T延伸10 min,4 T终止反应。产物进行电泳检测，纯化回收，由上海 生工测序部测序。

1.2.4苯胺含量的测定

苯胺含量测定采用国标法G B m1889-198沪，按下式计算结果

降解率(％)=(对照样品苯胺含量-所测样品苯胺含量)/对照样品苯胺含量x l〇〇%

1.2.5接种量、苯胺浓度对菌株D K降解率的影响

以无机盐培养基中培养生长60 h的菌液为接种液，按照0.5%、1%、2%、4%不同接种量接人到苯胺浓度为1 000 m g.L-1的无机盐培养基;以1%接种量分别接人苯胺浓度依次为300、500、700、900、1 100 m g.L-1的 无机盐培养基。测定苯胺降解率。

1.2.6不同水体环境中苯胺降解率变化

以1%的接种量转接菌株D K至超纯水、自来水、湖水中,水样中苯胺含量均为1 000 m g.IT1，测定3 d后 苯胺的降解率。