植物线粒体耗氧速率测定

I 线粒体的制备

【实验目的】

了解和掌握植物离体线粒体制备的方法。

【实验原理】

线粒体是进行呼吸氧化作用的细胞器，是能量的转换器，为了对这个细胞器的结构和功能进行研究，需要把它从细胞中分离出来，并测定其活性。

在接近生物材料自身的生理状态(合适的pH、一定的渗透浓度和低温条件)下破碎细胞，可采用分级离心方法将线粒体颗粒与其他细胞内含物在亚细胞水平上分开，然后在一定的离心力下收集线粒体。针对植物组织比较脆弱及其细胞含有较大量的有机酸等特点，不宜采取激烈的破碎方式，根据不同种类材料灵活掌握介质的pH。在介质中加入一些高分子化合物可除去酚类的干扰。为了去除其它细胞器的污染，获得纯净的线粒体，本实验采用蔗糖衬垫离心法进行提取。

【仪器设备】

冰冻高速离心机、研钵或、组织捣碎机、制冰机、冰箱、100ml离心管、烧杯、培养皿、恒温培养箱、移液器、纱布、漏斗、电子天平、容量瓶、磁力搅拌器等。

【材料及试剂】

1. 材料

挑选籽粒饱满的绿豆种子20g，用沸水烫后，均匀铺在带有湿润滤纸的培养皿中，37℃下黑暗萌发3-4d。去掉种皮和胚根，用滤纸吸干表面水分，放在4°C冰箱备用。

2. 试剂

①提取及洗涤介质：50mmol/LTris-HCl 缓冲液，pH8.0。内含0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、0.2mmol/L二硫苏糖醇和1mg/mL PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)；

②悬浮介质：除不加牛血清蛋白外，其余与提取介质相同；

③蔗糖溶液：0.6mol/L蔗糖，全用悬浮介质配制。

【实验步骤】

1. 离体线粒体的提取：称取10g去除种皮及胚根的绿豆幼苗放在4°C冰箱中饥饿1h，然后迅速在冰浴中研磨，开始加入少量提取介质，最后加至材料体积的一倍。

2. 匀浆用4层纱布过虑，滤液在4℃、1000g离心10min。

3. 取上清液，4℃、11000g离心20min。

4. 弃上清液，向沉淀中加入提取介质5mL，悬浮，4℃、11000g离心15min。

5. 弃上清液，收集沉淀，并悬浮于0.5ml悬浮介质中。

6. 加入25mL洗涤介质，4℃、1000g离心10min，取上清液，4℃保存备用。

7. 取一干净的50mL离心管，加入20mL0.6mol/L的蔗糖溶液，然后将上一步骤中经过低速离心并洗涤过的线粒体悬液铺在0.6mol/L的蔗糖溶液上，4℃、11000g离心20min，所得沉淀即为纯化线粒体，用1ml悬浮介质悬浮，4℃保存备用。

8. 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝法)，根据所测定蛋白质含量，用悬浮介质将线粒体悬浮液稀释成2mg蛋白质/ml线粒体悬浮液，4℃保存备用。

II 线粒体耗氧测定

【实验目的】

掌握OXYGRAPH氧电极的操作方法和线粒体耗氧测定技术。

【实验原理】

氧电极又称Clark电极，由嵌在绝缘棒上的铂和银构成，以氯化钾溶液为电解质，覆盖一层15-20mm厚的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜，两极之间为极化电压。溶氧可透过薄膜进入电极，在铂阴极上还原，同时在极间产生扩散电流，此电流与溶解氧浓度成正比。氧电极可以直接测量溶液中溶解氧的浓度，并且对溶液中氧的吸收或释放所引起的浓度变化十分敏感。具有活性的线粒体，供给底物表现出呼吸耗氧，因此可用氧电极测定线粒体的活性即呼吸强度。